Adquisición de imágenes de cara de bloques en serie para la microscopía electrónica volumétrica

Desentrañar la compleja arquitectura en 3D de células y tejidos en su contexto natural es crucial para la correlación estructura-función en los sistemas biológicos. En los últimos años, se han producido avances considerables en los métodos basados en SEM para la reconstrucción en 3D de grandes volúmenes de tejido. El SEM de cara de bloques en serie (SBF-SEM) combina el corte en secciones in situ y la adquisición de imágenes de bloques de tejido integrados en plástico dentro de la cámara de vacío de SEM de forma totalmente automatizada para la reconstrucción de grandes volúmenes de tejido. Hasta ahora, la resolución axial estaba limitada por el grosor mínimo de la sección que se puede cortar desde la cara de los bloques; sin embargo, con una combinación de SBF-SEM y SEM de deconvolución de la multienergía (MED-SEM), el Thermo Scientific VolumeScope 2 SEM permite ahora la adquisición de imágenes de gran volumen con una resolución en 3D verdaderamente isotrópica.

Durante la adquisición de imágenes de cara de bloques en serie, el haz de electrones se utiliza primero para explorar la superficie de una muestra de tejido integrada en resina, a la vez que adquiere una imagen en 2D de la muestra.

Esta superficie superior se retira posteriormente con un micrótomo in situ. El grosor de cada sección está definido por el usuario, pero suele ser superior a 15-20 µm. Una vez descartada esta sección, se recoge mediante un dispositivo de recogida de residuos.

A continuación, se adquiere una imagen de la superficie fresca con el SEM. Este proceso se repite hasta que se haya obtenido una imagen de toda la muestra; la altura total de la muestra puede oscilar entre decenas y cientos de micrómetros o más. A continuación, la pila de imágenes en serie se procesa mediante el software de renderizado en 3D.

El proceso de adquisición de imágenes de cara de bloques en serie se puede optimizar y refinar para adaptarse a las necesidades y requisitos específicos del usuario o de la muestra, incluidas las regiones de interés localizadas, varias áreas o varios detectores de imágenes.

El SEM de deconvolución de la multienergía (MED-SEM) es una forma novedosa de mejorar la resolución axial combinando el corte en secciones mecánico con el óptico. Tras el corte en secciones in situ de la cara de bloques con una cuchilla de diamante, se adquieren varias imágenes del tejido recién expuesto utilizando voltajes de aceleración crecientes. Estas imágenes se utilizan posteriormente en un algoritmo de deconvolución para derivar varias capas ópticas de subsuperficiales, lo que forma un subconjunto en 3D. Al repetir este ciclo, el VolumeScope 2 SEM ofrece conjuntos de datos isotrópicos con una resolución Z de 10 nm.

Protocolo estandarizado mediante el software de visualización Thermo Scientific Amira, para cuantificar las morfologías de los orgánulos en 3D, lo que ofrece mediciones precisas y reproducibles de estas subestructuras celulares. Se aplicó el protocolo con el software SBF-SEM y Amira para cuantificar las estructuras de las mitocondrias y del retículo endoplasmático (ER).

«Antes navegaba por Internet. Ahora navego por conjuntos de datos. La estructura es función y ese es el dogma de la biología celular».

El profesor Jeffrey Salisbury, de Mayo Clinic, habla de sus más de 45 años de experiencia en microscopía para dar respuesta a varias cuestiones biológicas, incluidas las recientes investigaciones en 3D con imágenes de cara de bloques en serie para analizar la arquitectura en 3D de varias muestras de tejido, riñón y cerebro en estados normales y enfermos.

«Son tiempos increíblemente emocionantes y por fin tenemos la oportunidad de hacer biología celular de verdad y durante todos estos años he estado sentado esperando y me impaciento por empezar».

Christopher Gilpin, director del Centro de Microscopía Electrónica de Purdue, habla sobre la adquisición de imágenes de cara de bloques en serie y su posible uso para el mapeo biológico a escala múltiple en el contexto de las técnicas de adquisición de imágenes en 3D.