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Ensaios BCA e de Lowry
Quantificação total de proteínas baseada em cobre
O ensaio de proteína BCA é um método popular para detecção colorimétrica e quantificação da proteína total. Os ensaios de proteína BCA Pierce têm uma vantagem exclusiva em relação aos ensaios baseados em corante Coomassie (Bradford): eles são compatíveis com amostras que contêm até 5% de surfatantes (detergentes) e são afetados muito menos pelas diferenças de composição da proteína, proporcionando maior uniformidade de proteína para proteína.
Seleção de ensaio de proteína Manual técnico de ensaio de proteína
Escolha o ensaio de proteína BCA correto para a sua amostra
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| Ensaio de proteína BCA Rapid Gold | Ensaio de proteína BCA | Ensaio de proteína BCA - Compatível com agente redutor | Ensaio de proteína Micro BCA | |
|---|---|---|---|---|
| Faixa do ensaio: (volume da amostra) | 20 µg/mL a 2.000 µg/mL (25 µL) | 20 µg/mL a 2.000 µg/mL (25 µL) | 125 µg/mL a 2.000 µg/mL (9 µL) | 2 µg/mL a 40 µg/mL (150 µL) ou 0,5 µg/mL a 20 µg/mL (500 µL) |
| Tempo e temperatura de incubação | 5 min em RT | 30 min a 37 °C | 45 min a 37 °C | 60 min a 60°C |
| Tempo total do ensaio | 50 min | 100 min | 115 min | 130 min |
| Absorbância | 480 nm | 562 nm | 562 nm | 562 nm |
| Reagentes compatíveis | Detergentes | Detergentes | Detergentes/agentes redutores (por exemplo DTT) | Detergentes |
| Reagentes incompatíveis | Agentes redutores; queladores | Agentes redutores; queladores | Queladores | Agentes redutores; queladores |
| Uniformidade | Menos variação proteína:proteína do que o método Coomassie | Menos variação proteína:proteína do que o método Coomassie | Significativamente menos (14% a 23%) de variação proteína:variação de proteína do que os métodos de corante Coomassie | Menos variação proteína:proteína do que os métodos BCA, Coomassie ou Lowry. |
| Tamanhos disponíveis | 250 mL/kit 500 mL/kit | 500 mL/kit 1 L/kit | 275 mL/kit | 500 mL/kit |
| Nº Cat. | A53225 | 23227 | 23250 | 23235 |
Visão geral dos kits BCA
- Ensaio de proteína BCA Rapid Gold: De verde a amarelo (A480 nm), ensaio de dois componentes, preciso e compatível com detergente para medir a proteína total ante o padrão de proteína em 5 minutos em temperatura ambiente
- Ensaio de proteína BCA: Reagente de ensaio de verde a roxo (A562 nm), de dois componentes, preciso e compatível com detergente para medir a concentração total de proteína ante o padrão de proteína em 30 minutos a 37 °C.
- Ensaio de proteína BCA- Compatível com agente redutor: Versão compatível com agente do nosso kit BCA para medir a concentração de proteínas em amostras contendo redutores DTT ou BME.
- Ensaio de proteína micro BCA – Versão especial de 3 componentes do nosso kit de reagentes BCA para medir a concentração total de proteínas de soluções diluídas (0,5 μg/mL a 20 μg/mL).
Princípios do ensaio de BCA
Química de ensaios de proteína baseados em BCA
Os ensaios de proteína BCA Pierce combinam a bem conhecida redução de Cu2+ a Cu+ por proteína em meio alcalino (também conhecido como reação de biureto) com a detecção colorimétrica altamente sensível e seletiva do cátion cuproso (Cu+) por ácido bicinconínico (BCA).
Figura 1. A primeira etapa é a quelação do cobre com proteína em um ambiente alcalino para formar um complexo de cor azul. Nessa reação, os peptídeos contendo três ou mais resíduos de aminoácidos formam um complexo de quelato colorido com íons cúpricos em um ambiente alcalino contendo tartarato de potássio sódico.
Os aminoácidos livres e os dipeptídeos não são afetados na reação de biureto, mas os tripeptídeos e os polipeptídeos ou proteínas maiores reagirão para produzir o complexo de luz azul-violeta claro que absorve a luz a 540 nm. Um íon cúprico forma um complexo de coordenação colorido com quatro a seis ligações peptídicas nas proximidades. A intensidade da cor produzida é proporcional ao número de ligações peptídicas que participam da reação.
Figura 2. Na segunda etapa, o reagente BCA, um reagente de detecção colorimétrica altamente sensível e seletivo, reage com o cátion cuproso (Cu+) que foi formada na primeira etapa e produz uma cor roxa.
O complexo de cobre-BCA é solúvel em água e apresenta uma forte absorbância linear a 562 nm com concentrações cada vez maiores de proteína. A cor roxa pode ser medida em qualquer comprimento de onda entre 550 nm e 570 nm com perda mínima (menor que 10%) de sinal. O sinal induzido pelo reagente BCA é aproximadamente 100 vezes mais sensível (limite inferior de detecção) do que o sinal que utiliza o reagente de biureto.
O ensaio de proteína BCA Rapid Gold Pierce usa o mesmo método de redução de cobre que o ensaio tradicional de BCA com um quelador de cobre exclusivo. Na segunda etapa da reação de desenvolvimento de cores, o quelador de BCA Rapid Gold Pierce reage com o cátion (cuproso) reduzido (CU+) que foi formado na etapa um para produzir um produto de reação intensamente dourado. O complexo de cobre apresenta uma forte absorbância linear a 480 nm com concentrações cada vez maiores de proteína.
Quantificação de proteína BCA
Uma das principais vantagens do ensaio de BCA é que ele produz uma curva de resposta linear. Essa curva de resposta permite a determinação precisa de concentrações desconhecidas de proteínas e fornece uma faixa dinâmica mais alta do que outros ensaios padrão.
Figura 3. Curvas padrão para ensaios de quantificação de proteínas. (A) BSA purificada em solução salina a 0,9% (0 mg/mL a 2 mg/mL) foi usada para gerar curvas padrão para o ensaio de proteína BCA Rapid Gold Pierce e o ensaio de BCA padrão. Os dois ensaios foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante, em formato de microplaca. (B) O mesmo método descrito em (A) foi utilizado para gerar curvas-padrão para o ensaio de proteína Rapid Gold BCA Pierce e o ensaio de proteína Bio-Rad Bradford.
Outra grande vantagem dos ensaios de proteína BCA é a baixa variação de proteína para proteína. As proteínas são diversas em sua composição e estrutura e, com alguns ensaios, as diferenças de proteínas na sequência de aminoácidos, ponto isoelétrico (PI), estrutura secundária e cadeias laterais ou grupos protéticos resultam em variação na resposta colorimétrica. Essa baixa variação de proteína a proteína leva a uma maior precisão na determinação da concentração de proteína para amostras de proteínas desconhecidas.
Figura 4. Precisão do ensaio de proteína BCA Rapid Gold Pierce e do ensaio de proteína Bradford com misturas de proteínas conhecidas. Os dois ensaios foram realizados de acordo com os protocolos dos respetivos fabricantes, em formato de microplaca. As concentrações conhecidas foram baseadas nas concentrações indicadas pelos fabricantes e confirmadas pela absorbância a 280 nm.
Quantificação de proteínas com ensaio de proteína BCA Pierce
O ensaio de proteína BCA Pierce produz uma curva de resposta linear (R2 > 0,95) e pode ser realizado usando dois formatos diferentes, com base na faixa dinâmica necessária para detectar a concentração de proteína de uma amostra desconhecida. O ensaio de proteína BCA Pierce padrão detecta concentrações de proteína de 20 μg/mL a 2.000 μg/mL, usando um sistema de dois componentes: Reagente A, um tampão de carbonato contendo reagente BCA e reagente B e uma solução de sulfato cúprico, que são combinados para formar uma solução de trabalho de cor verde-maçã que fica roxa depois de 30 minutos a 37 °C na presença de proteína. Como a reação de cor não é uma verdadeira reação de endpoint, é permitida uma considerável flexibilidade de protocolo com o ensaio de proteína BCA Pierce. Ao aumentar a temperatura de incubação, a sensibilidade do ensaio pode ser aumentada. Ao utilizar o protocolo de tubo melhorado (isto é, a incubação a 60 °C durante 30 minutos), o intervalo de trabalho para o ensaio muda para 5 μg/mL a 250 μg/mL, facilitando a detecção de mais amostras diluídas.
Figura 5. Protocolo do kit de ensaio de proteína BCA.
Protocolo do kit de ensaio de proteína BCA Rapid Gold
Esse ensaio colorimétrico fornece a alta sensibilidade e linearidade associadas ao ensaio de BCA, mas em uma fração do tempo necessário para executar um ensaio de BCA padrão. O ensaio pode ser concluído em 5 minutos em temperatura ambiente, eliminando a necessidade de aguardar ou de expor as amostras a temperaturas elevadas.
Figura 6. Protocolo do kit de ensaio de proteína BCA Rapid Gold.
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| Kit de ensaio de proteína Lowry modificado | |
|---|---|
| Intervalo do ensaio: microplaca (volume da amostra) | 10 µg/mL a 1.500 µg/mL (40 µL) |
| Intervalo do ensaio: cubeta (volume da amostra) | 1 µg/mL, 1.500 µg/mL (200 µL) |
| Tempo e temperatura de incubação | 10 e 30 min em RT |
| Tempo total do ensaio | 110 min |
| Absorbância | 750 nm |
| Reagentes compatíveis | SDS (até 1%) |
| Reagentes incompatíveis | Reagentes redutores, queladores, detergentes, tris, tricina, glicerol |
| Uniformidade | Menos variação proteína:proteína do que os métodos de corante Coomassie |
| Tamanho do produto | 530 mL/kit |
| Nº Cat. | 23240 |
Princípios do ensaio de Lowry
O ensaio de proteína Lowry modificado Pierce baseia-se no método colorimétrico introduzido por Oliver H. Lowry em 1951. O ensaio modificado Pierce substitui dois dos reagentes instáveis tradicionais do ensaio por um único reagente mais estável.
Química do ensaio de Lowry modificado Pierce
O ensaio de proteína Lowry modificado Pierce é um ensaio de biureto aprimorado que envolve química de quelação de cobre. Embora o mecanismo de formação de cores para o ensaio de proteína Lowry modificado Pierce seja semelhante ao do ensaio de proteína BCA Pierce, há várias diferenças significativas entre os dois. Embora o mecanismo preciso para a formação de cores usando o ensaio de proteína Lowry modificado Pierce não seja completamente compreendido, sabe-se que a reação ocorre como duas etapas distintas. Primeiro, a proteína reage com sulfato cúprico alcalino na presença de tartarato durante uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Durante essa incubação, um complexo de cobre tetradentato se forma a partir de quatro ligações peptídicas e um átomo de cobre, com cor azul-claro (essa é a "reação de biureto"). Depois da incubação, o reagente de fenol, Folin, é adicionado. Acredita-se que o aprimoramento de cores ocorra quando o complexo de cobre tetradentato transfere elétrons para o complexo de ácido fosfomolibdico-fosfotungstico (o reagente de fenol, Folin). O complexo de ácido fosfomolibdico-fosfotungstico reduzido produzido por essa reação é intensamente azul.
Figura 7. Esquema de reação para o kit de ensaio de proteína Lowry modificado Pierce.
Figura 8. Protocolo do ensaio de proteína Lowry modificado Pierce
Manuais & protocolos
Guias técnicos & de aplicação
Escolha o ensaio de proteína BCA correto para a sua amostra
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| Ensaio de proteína BCA Rapid Gold | Ensaio de proteína BCA | Ensaio de proteína BCA - Compatível com agente redutor | Ensaio de proteína Micro BCA | |
|---|---|---|---|---|
| Faixa do ensaio: (volume da amostra) | 20 µg/mL a 2.000 µg/mL (25 µL) | 20 µg/mL a 2.000 µg/mL (25 µL) | 125 µg/mL a 2.000 µg/mL (9 µL) | 2 µg/mL a 40 µg/mL (150 µL) ou 0,5 µg/mL a 20 µg/mL (500 µL) |
| Tempo e temperatura de incubação | 5 min em RT | 30 min a 37 °C | 45 min a 37 °C | 60 min a 60°C |
| Tempo total do ensaio | 50 min | 100 min | 115 min | 130 min |
| Absorbância | 480 nm | 562 nm | 562 nm | 562 nm |
| Reagentes compatíveis | Detergentes | Detergentes | Detergentes/agentes redutores (por exemplo DTT) | Detergentes |
| Reagentes incompatíveis | Agentes redutores; queladores | Agentes redutores; queladores | Queladores | Agentes redutores; queladores |
| Uniformidade | Menos variação proteína:proteína do que o método Coomassie | Menos variação proteína:proteína do que o método Coomassie | Significativamente menos (14% a 23%) de variação proteína:variação de proteína do que os métodos de corante Coomassie | Menos variação proteína:proteína do que os métodos BCA, Coomassie ou Lowry. |
| Tamanhos disponíveis | 250 mL/kit 500 mL/kit | 500 mL/kit 1 L/kit | 275 mL/kit | 500 mL/kit |
| Nº Cat. | A53225 | 23227 | 23250 | 23235 |
Visão geral dos kits BCA
- Ensaio de proteína BCA Rapid Gold: De verde a amarelo (A480 nm), ensaio de dois componentes, preciso e compatível com detergente para medir a proteína total ante o padrão de proteína em 5 minutos em temperatura ambiente
- Ensaio de proteína BCA: Reagente de ensaio de verde a roxo (A562 nm), de dois componentes, preciso e compatível com detergente para medir a concentração total de proteína ante o padrão de proteína em 30 minutos a 37 °C.
- Ensaio de proteína BCA- Compatível com agente redutor: Versão compatível com agente do nosso kit BCA para medir a concentração de proteínas em amostras contendo redutores DTT ou BME.
- Ensaio de proteína micro BCA – Versão especial de 3 componentes do nosso kit de reagentes BCA para medir a concentração total de proteínas de soluções diluídas (0,5 μg/mL a 20 μg/mL).
Princípios do ensaio de BCA
Química de ensaios de proteína baseados em BCA
Os ensaios de proteína BCA Pierce combinam a bem conhecida redução de Cu2+ a Cu+ por proteína em meio alcalino (também conhecido como reação de biureto) com a detecção colorimétrica altamente sensível e seletiva do cátion cuproso (Cu+) por ácido bicinconínico (BCA).
Figura 1. A primeira etapa é a quelação do cobre com proteína em um ambiente alcalino para formar um complexo de cor azul. Nessa reação, os peptídeos contendo três ou mais resíduos de aminoácidos formam um complexo de quelato colorido com íons cúpricos em um ambiente alcalino contendo tartarato de potássio sódico.
Os aminoácidos livres e os dipeptídeos não são afetados na reação de biureto, mas os tripeptídeos e os polipeptídeos ou proteínas maiores reagirão para produzir o complexo de luz azul-violeta claro que absorve a luz a 540 nm. Um íon cúprico forma um complexo de coordenação colorido com quatro a seis ligações peptídicas nas proximidades. A intensidade da cor produzida é proporcional ao número de ligações peptídicas que participam da reação.
Figura 2. Na segunda etapa, o reagente BCA, um reagente de detecção colorimétrica altamente sensível e seletivo, reage com o cátion cuproso (Cu+) que foi formada na primeira etapa e produz uma cor roxa.
O complexo de cobre-BCA é solúvel em água e apresenta uma forte absorbância linear a 562 nm com concentrações cada vez maiores de proteína. A cor roxa pode ser medida em qualquer comprimento de onda entre 550 nm e 570 nm com perda mínima (menor que 10%) de sinal. O sinal induzido pelo reagente BCA é aproximadamente 100 vezes mais sensível (limite inferior de detecção) do que o sinal que utiliza o reagente de biureto.
O ensaio de proteína BCA Rapid Gold Pierce usa o mesmo método de redução de cobre que o ensaio tradicional de BCA com um quelador de cobre exclusivo. Na segunda etapa da reação de desenvolvimento de cores, o quelador de BCA Rapid Gold Pierce reage com o cátion (cuproso) reduzido (CU+) que foi formado na etapa um para produzir um produto de reação intensamente dourado. O complexo de cobre apresenta uma forte absorbância linear a 480 nm com concentrações cada vez maiores de proteína.
Quantificação de proteína BCA
Uma das principais vantagens do ensaio de BCA é que ele produz uma curva de resposta linear. Essa curva de resposta permite a determinação precisa de concentrações desconhecidas de proteínas e fornece uma faixa dinâmica mais alta do que outros ensaios padrão.
Figura 3. Curvas padrão para ensaios de quantificação de proteínas. (A) BSA purificada em solução salina a 0,9% (0 mg/mL a 2 mg/mL) foi usada para gerar curvas padrão para o ensaio de proteína BCA Rapid Gold Pierce e o ensaio de BCA padrão. Os dois ensaios foram realizados de acordo com os protocolos do fabricante, em formato de microplaca. (B) O mesmo método descrito em (A) foi utilizado para gerar curvas-padrão para o ensaio de proteína Rapid Gold BCA Pierce e o ensaio de proteína Bio-Rad Bradford.
Outra grande vantagem dos ensaios de proteína BCA é a baixa variação de proteína para proteína. As proteínas são diversas em sua composição e estrutura e, com alguns ensaios, as diferenças de proteínas na sequência de aminoácidos, ponto isoelétrico (PI), estrutura secundária e cadeias laterais ou grupos protéticos resultam em variação na resposta colorimétrica. Essa baixa variação de proteína a proteína leva a uma maior precisão na determinação da concentração de proteína para amostras de proteínas desconhecidas.
Figura 4. Precisão do ensaio de proteína BCA Rapid Gold Pierce e do ensaio de proteína Bradford com misturas de proteínas conhecidas. Os dois ensaios foram realizados de acordo com os protocolos dos respetivos fabricantes, em formato de microplaca. As concentrações conhecidas foram baseadas nas concentrações indicadas pelos fabricantes e confirmadas pela absorbância a 280 nm.
Quantificação de proteínas com ensaio de proteína BCA Pierce
O ensaio de proteína BCA Pierce produz uma curva de resposta linear (R2 > 0,95) e pode ser realizado usando dois formatos diferentes, com base na faixa dinâmica necessária para detectar a concentração de proteína de uma amostra desconhecida. O ensaio de proteína BCA Pierce padrão detecta concentrações de proteína de 20 μg/mL a 2.000 μg/mL, usando um sistema de dois componentes: Reagente A, um tampão de carbonato contendo reagente BCA e reagente B e uma solução de sulfato cúprico, que são combinados para formar uma solução de trabalho de cor verde-maçã que fica roxa depois de 30 minutos a 37 °C na presença de proteína. Como a reação de cor não é uma verdadeira reação de endpoint, é permitida uma considerável flexibilidade de protocolo com o ensaio de proteína BCA Pierce. Ao aumentar a temperatura de incubação, a sensibilidade do ensaio pode ser aumentada. Ao utilizar o protocolo de tubo melhorado (isto é, a incubação a 60 °C durante 30 minutos), o intervalo de trabalho para o ensaio muda para 5 μg/mL a 250 μg/mL, facilitando a detecção de mais amostras diluídas.
Figura 5. Protocolo do kit de ensaio de proteína BCA.
Protocolo do kit de ensaio de proteína BCA Rapid Gold
Esse ensaio colorimétrico fornece a alta sensibilidade e linearidade associadas ao ensaio de BCA, mas em uma fração do tempo necessário para executar um ensaio de BCA padrão. O ensaio pode ser concluído em 5 minutos em temperatura ambiente, eliminando a necessidade de aguardar ou de expor as amostras a temperaturas elevadas.
Figura 6. Protocolo do kit de ensaio de proteína BCA Rapid Gold.
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| Kit de ensaio de proteína Lowry modificado | |
|---|---|
| Intervalo do ensaio: microplaca (volume da amostra) | 10 µg/mL a 1.500 µg/mL (40 µL) |
| Intervalo do ensaio: cubeta (volume da amostra) | 1 µg/mL, 1.500 µg/mL (200 µL) |
| Tempo e temperatura de incubação | 10 e 30 min em RT |
| Tempo total do ensaio | 110 min |
| Absorbância | 750 nm |
| Reagentes compatíveis | SDS (até 1%) |
| Reagentes incompatíveis | Reagentes redutores, queladores, detergentes, tris, tricina, glicerol |
| Uniformidade | Menos variação proteína:proteína do que os métodos de corante Coomassie |
| Tamanho do produto | 530 mL/kit |
| Nº Cat. | 23240 |
Princípios do ensaio de Lowry
O ensaio de proteína Lowry modificado Pierce baseia-se no método colorimétrico introduzido por Oliver H. Lowry em 1951. O ensaio modificado Pierce substitui dois dos reagentes instáveis tradicionais do ensaio por um único reagente mais estável.
Química do ensaio de Lowry modificado Pierce
O ensaio de proteína Lowry modificado Pierce é um ensaio de biureto aprimorado que envolve química de quelação de cobre. Embora o mecanismo de formação de cores para o ensaio de proteína Lowry modificado Pierce seja semelhante ao do ensaio de proteína BCA Pierce, há várias diferenças significativas entre os dois. Embora o mecanismo preciso para a formação de cores usando o ensaio de proteína Lowry modificado Pierce não seja completamente compreendido, sabe-se que a reação ocorre como duas etapas distintas. Primeiro, a proteína reage com sulfato cúprico alcalino na presença de tartarato durante uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente. Durante essa incubação, um complexo de cobre tetradentato se forma a partir de quatro ligações peptídicas e um átomo de cobre, com cor azul-claro (essa é a "reação de biureto"). Depois da incubação, o reagente de fenol, Folin, é adicionado. Acredita-se que o aprimoramento de cores ocorra quando o complexo de cobre tetradentato transfere elétrons para o complexo de ácido fosfomolibdico-fosfotungstico (o reagente de fenol, Folin). O complexo de ácido fosfomolibdico-fosfotungstico reduzido produzido por essa reação é intensamente azul.
Figura 7. Esquema de reação para o kit de ensaio de proteína Lowry modificado Pierce.
Figura 8. Protocolo do ensaio de proteína Lowry modificado Pierce
Manuais & protocolos
Guias técnicos & de aplicação
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.