化学标记支持 - 入门

是的，只要目标分子具有与可用的标记产品合适的反应基团。如果您的分子没有适合于我们的多种反应标记物的合适反应位点，请参考题为“HPLC的衍生化方法手册”的文章，了解其他标记选择。

共价修饰之后，相对于没标记的分子，经过标记的分子功能可能发生了改变，须通过经验来判定其可被接受的功能和本底水平。

• 待标记的分子：
  • 必须含有合适的标记位点，例如：伯胺、硫醇、羧基、磷酸盐等
  • 在反应溶液中必须可溶和稳定
  • 在分离标记与非标记分子过程中，必须经得起某些形式的反应后纯化。反应后的纯化可采用分子体积排阻色谱、透析、HPLC、电泳或其他适当的方法。

• 反应标记物必须容易接触到结合位点。
• 分子上的目标反应位点不可以有竞争位点。例如，如果使用碳化二亚胺-激活（例如使用EDAC，CDC）羧基法结合氨基末端的标记，则被标记分子中不应该含有任何易接触的磷酸盐，因为磷酸盐同样可以在此条件下激活并被标记。

不能。对于大分子来说，可能含有多个标记反应位点（例如蛋白表面的赖氨酸），用胺反应试剂的标记属于“鸟枪法”或随机法标记。不可能控制偶联的位点，终产物将会是标记于整个蛋白表面不同位点的标记蛋白混合物。

• 首先，选择一个与你仪器上的光源和滤片/通道匹配的荧光团，以保证合适的激发和发射水平，并确保能够被充分检测到。
• 第二，了解自己的分子的性质。您的分子是亲水、疏水，还是整体阳离子或阴离子？您可能希望将疏水的分子标记上疏水的染料（例如我们的BODIPY™染料）来保持分子的整体疏水性。如果你有一个内在阳离子肽或者其他分子，你可能希望结合上一个阳离子罗丹明染料。如果这个分子是大分子阴离子，可使用阴离子染料，如荧光素或某些Alexa Fluor™染料。
• 第三，测定适合您的分子标记位点和范围。例如，使用一个量子点（Qdot™探针）结合于完整抗体（SiteClick™试剂盒）的Fc部分，相对于使用有机染料结合于抗体表面的任何部位要更好。如果在抗体的抗原结合位点上或附近含有赖氨酸，标记上胺反应染料可能会导致抗体失效。

我们强烈建议您测定DOL。DOL可通过测定260 nm（用于核酸）或280 nm（用于蛋白）处的吸光度读数加上荧光团最大吸光度测得。仅仅通过吸光度读数，就可以测定标记反应是否成功，并且如果今后要对相同分子进行后续标记，DOL测定能够确定这种分子最佳标记程度。

荧光检测不能判定分子是否标记以及过度标记——所有的这些标记情况可能产生同样水平的少量荧光或无荧光。使用某些染料，过度标记会导致染料间的抑制，导致无法检测到荧光，但是可通过吸光度检测法检出。同样，目测标记分子的溶液颜色也不可用于判定其是否适当标记。

对于生物素标记的分子，可以通过使用HABA试验或其他类似试验（参见FluoReporter™ Biotin Quantitation Assay Kit，货号B30751）进行DOL的测定。

可以。根据反应化学法，标记可以在有机溶剂（如DMSO、DMF、乙腈、乙醇或其它溶剂）中进行。相关信息请见《生物偶联技术》（Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press）或Labeling Small Peptides with Amine-Reactive Dyes in Organic Solvents.

荧光团偶联分子的信号丢失的原因多种多样，具体取决于丢失是否由分子性质或附在分子上的荧光团造成。结合不佳或者无标记分子相关的高的结合/剥离速率，都可能导致信号很弱。蛋白或其他分子可被蛋白酶消化，形成后续的产物包含小的荧光团结合的肽或者氨基酸，可能变得太分散从而难以检测或冲洗掉。相比于未标记的分子，有些应该标记的分子可能会被活细胞大量的泵出细胞外。

结合在目的探针上的荧光可能会发生光漂白、淬灭或降解。一些显色染料（例如酚红，台盼蓝）、二甲苯或其它试剂的存在会瞬间淬灭一些荧光素；一旦移除这些成分后，荧光素依旧会发荧光。而光漂白、氧化、还原或其他因素则可导致荧光素发生不可逆地降解。请避光储存，避免接触极端pH、强氧化或还原试剂、重金属；对于荧光蛋白，例如GFP或藻胆蛋白（R-PE, APC），避免任何可促使其消化（如蛋白酶）、去折叠、变性的因素。