미세유체역학 어레이 플레이트 기술

구획화는 디지털 PCR의 기본

384-well 플레이트는 1988년 도입 당시, 희귀 표적 검출을 위한 "희석 제한" 원칙을 입증하는 데 사용되었습니다 (1). 디지털 PCR(dPCR)을 사용한 DNA 증폭 및 정량화가 발전함에 따라 시약 분배 또는 구획화 방법도 발전했습니다. 오늘날 사용할 수 있는 가장 일반적인 방법 중 하나는 미세유체역학 기술을 사용하여 droplet으로 유화를 통해 작고 격리된 수많은 반응을 생성하는 것입니다. 이를 통해 dPCR 반응당 수만 개의 훨씬 더 작은 부피의 droplet을 생성할 수 있습니다. droplet의 수를 늘리면 희귀 표적을 검출할 가능성이 그만큼 높아지고 더 높은 농도의 표적에 대한 정확도가 향상되어 본질적으로 동적 범위가 확장됩니다(2,3).

정밀하고 정확한 디지털 PCR

Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q Digital PCR 시스템은 고유한 미세유체역학 어레이 플레이트(MAP) 기술을 활용하여 정밀도 높은 dPCR 결과를 제공합니다. 작용 원리:

MAP(그림 1)에는 16개의 dPCR 반응 단위가 있으며 반투명 사각형으로 쉽게 구분할 수 있습니다. 확대하면 각 dPCR 반응 장치(반투명 사각형)는 20,480개의 고정 어레이 마이크로 챔버로 구성되어 있습니다. 마이크로 챔버 자체는 PCR 시약 전달에 사용되는 분배 네트워크로 연결됩니다. 시약이 마이크로 챔버로 구획화되면 PCR 증폭이 진행되고 DNA 증폭이 성공한 마이크로 챔버의 수가 산출됩니다.

그림 1. 미세유체역학 어레이 플레이트 기술

타 dPCR 방법에 비해 높은 일관성

일부 에멀젼 기반 또는 droplet 디지털 PCR(ddPCR) 기술은 개별 구획을 생성하기 위해 고유한 확률적 프로세스(유체 전단)에 의존하여 일관성이 떨어집니다. 이로 인해 dPCR 반응당 생성된 구획의 총 수의 편차가 클 수 있습니다.

반면, QuantStudio Absolute Q MAP 기술은 구획 또는 마이크로 챔버를 형성하기 위해 droplet에 사용되는 유체 전단 또는 과잉 시약의 물리적 변위에 의존하지 않습니다. 따라서, MAP 기술은 탁월한 일관성, 시약 낭비 감소 및 간소화된 워크플로우 외에도 전반적으로 더 큰 부피 정밀도, 더 많은 수의 마이크로 챔버 생성 및 더 정확한 정량화를 가능하게 합니다.

간단한 데이터 확인

QuantStudio Absolute Q 시스템의 MAP16 플레이트에 의해 생성된 데이터 유형을 입증하기 위해 QuantStudio Absolute Q 시스템의 4가지 광학 채널을 모두 사용하여 표적 1(FAM), 표적 2(VIC), 표적 3(ABY), 표적 4(CY5)를 검출하는 다중 어세이를 사용했습니다. 그림 2는 MAP16 플레이트의 단일 반응에서 QuantStudio Absolute Q 분석 소프트웨어에 의해 생성된 마이크로 챔버 양성의 결과 dPCR 형광 플롯과 맵을 보여줍니다.

그림 2. 4개의 채널을 사용한 다중 실행을 보여주는 MAP16 플레이트.

매 회 20,000개의 dPCR 미세반응 생성

마이크로 챔버 충진의 탁월한 일관성을 강조하기 위해 다양한 분석에 대해 MAP에서 높은 허용 마이크로 챔버 수의 반복성을 입증하는 연구를 수행했습니다(그림 3). 이 연구를 위해 자체 표준 QC 어세이를 사용하여 플레이트 14개에 대한 분석 검사를 수행했습니다. dPCR 워크플로우에서 dPCR이 완료되면 QuantStudio Absolute Q 분석 소프트웨어는 QC 채널을 사용하여 dPCR 반응 또는 어레이 내에서 각 마이크로 챔버를 찾아 검사한 후 균일하게 채워지고 PCR과 무관한 자동 형광 잔여물의 징후가 없는 마이크로 챔버만 수용합니다. 연구에서 사용된 플레이트 14개를 분석한 결과, 평균 마이크로 챔버 수용률이 99.7%(±0.6%)로 확인되었습니다. 14개의 MAP 각각에 대해 어레이당 허용되는 마이크로 챔버의 총 수를 도표로 나타내어 각 플레이트에서 전반적인 일관성을 시각화했습니다. 20,480의 점선은 MAP에서 사용 가능한 총 마이크로 챔버 수를 나타냅니다. 모든 어레이에서 플레이트당 평균 20,417(±133)개의 마이크로 챔버가 수용되는 것을 확인했습니다.

그림 3을 확대하려면 이미지를 클릭하십시오.

분석된 마이크로 챔버 수가 중요한 이유는?

dPCR 분석은 통계에 기반하기 때문입니다.

포아송(Poisson) 모델링(위)을 사용하는 경우, dPCR 반응에서 최종 농도를 계산할 때 분석된 총 마이크로 챔버 수와 마이크로 챔버 부피를 모두 사용합니다. 따라서 두 변수 모두 매우 일관적이고 정확하게 계산되어야 합니다. MAP 기술은 수용 가능한 전체 마이크로챔버의 일관성을 향상시키고, 결과적으로 전체적인 부피 정밀도를 향상시킵니다.

추가 리소스

참고문헌

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988;239(4839):487‐491.
Huggett JF, Foy CA, Benes V, et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin Chem. 2013;59(6):892‐902.
Quan PL, Sauzade M, Brouzes E. dPCR: 기술 검토. Sensors(Basel). 2018;18(4):1271.

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