SeqStudio Flex Genetic Analyzers

Amplification of DNA sequences by polymerase chain reaction (PCR) remains the workhorse for almost all aspects of molecular biology and genomic research.  There is an increasing need to analyze many targets in a single sample.  However, this can be tedious by PCR, involving setting up individual reactions for each of the desired targets.  Methods that can analyze multiple sequences from a single sample would simplify workflows and conserve precious samples.  One method to address this is fragment analysis by capillary electrophoresis (CE).  CE separates amplicons based on both size and fluor in a single capillary allowing a very large number of targets to be analyzed within a single sample.  

Multiplexed PCR coupled with fragment analysis presents a tremendous opportunity to perform complex analyses with minimal expense or effort.  Experiments are limited only by the ability to design primer sets against the targets of interest.  It can therefore be adapted and utilized in nearly any scenario where detection of many target sequences in a single sample is desired.  

This example demonstrates the power of multiplexed PCR by fragment analysis using a custom panel for detecting respiratory viral pathogens.  A panel of PCR primers containing 6-FAM labeling at the 5’-end were designed to detect 12 different respiratory RNA viruses, including rhinovirus, RSV-B, influenza A H1, influenza A H3, influenza B, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus OC43, and coronavirus 229E, as well as SARS-CoV-2 S, N, and orf1ab, so that each organism generated a different sized amplicon.  The resulting amplicons could be separated and examined using the SeqStudio, SeqStudio 24 Flex, or 3500xL genetic analyzers.

게놈 분석을 시작하거나 다음 단계를 계속하기 전에 이중 나선 DNA(dsDNA)의 시작 풀에서 품질 검사(QC)를 실행해야 하는 경우가 종종 있습니다. 예를 들어, FFPE 보존 조직에서 추출한 DNA는 절편화되고 너무 작아서 유용한 정보를 제공할 수 없기 때문에 진행하기 전에 전체 크기를 파악하는 것이 유용합니다.

SeqStudio Flex Genetic Analyzers 시리즈에서 dsDNA 절편의 크기와 상대 존재비를 분석할 수 있습니다. 프로토콜에서 형광성 DNA 삽입 염료인 TOTO-1은 검체와 함께 인큐베이션되며, 이는 모세관 히터가 꺼진 상태에서 POP7 폴리머를 관통합니다. (이는 DNA를 크게 이중 나선, 비변성 상태로 유지합니다.) 검사 절편의 결과적 이동과 알려진 dsDNA 표준의 이동을 비교하여 검사 절편의 크기를 결정할 수 있습니다.

이 검사에서 그림에 표시된 두 개의 알려진 dsDNA 표준을 포함하여 여러 가지 DNA 검체를 분석하는 데 있어 SeqStudio Flex Genetic Analyzer와 3500xL Genetic Analyzer의 성능을 평가했습니다. 패널 A는 HindIII로 분해된 파지 람다 DNA의 분석을 보여주며, 23,130~125bp 범위의 8개 절편의 친숙한 패턴을 보여줍니다. 패널 B는 BsuRI로 분해된 파지 phiX174와 동일한 람다 HindIII 분해물의 혼합물을 보여줍니다. 8개의 람다 절편 외에도 1,353~72bp 범위의 절편이 10개 더 검출되었습니다. SeqStudio Flex(왼쪽) 및 3500xL(오른쪽) 기기에서 얻은 프로파일은 매우 유사하며, 3500 시리즈 대비 신규 기기를 검증했습니다.

일부 조사에서는 유전체의 특정 영역에 대한 집중 염기서열 정보가 필요합니다. NGS와 같은 유전체 범위의 발견 도구는 매우 큰 영역에 걸쳐 광범위한 데이터를 제공하지만 집중 연구에 이러한 복잡한 접근법이 항상 필요한 것은 아닙니다. Sanger 염기서열분석은 유전체 영역의 최적 표준 염기서열분석을 위한 간단하고 비용 효율적이며 쉽게 해석할 수 있는 솔루션을 제공합니다. 

집중 염기서열분석을 입증하기 위해 당사는 전체 SARS-CoV-2 스파이크 유전자에 대한 12쌍의 염기서열분석 프라이머를 확인했던 이전 연구에 기반하여, 스파이크 단백질과 인접 염기서열을 포함하는 SARS-CoV-2 유전체 영역에 대한 염기서열분석을 실시하였습니다. 12개의 중첩 앰플리콘에 포함된 SARS-CoV-2의 스파이크 유전자 영역은 5kb에 걸쳐 확장됩니다.

그림의 패널 A에서, 그림에 나타난 바와 같이 거의 모든 12개의 앰플리콘에서 고품질 Sanger 염기서열분석 결과(밝은 파란색 막대 높이로 표시)를 얻었습니다.

이러한 결과를 SARS-CoV-2 스파이크 유전자의 단일 콘틱 판독으로 조합했습니다. 판독 품질 지표는 세 분석기 모두에서 거의 동일했습니다. 여기서 입증된 바와 같이, 일관된 염기 결정 품질을 통해 Sanger 염기서열분석으로 중첩되는 중간 길이 앰플리콘을 사용하여 집중 영역의 염기서열을 조합할 수 있으며, 관심 영역을 포함하는 콘틱을 생성할 수 있습니다.