Preparación de muestras
Efectos de la matriz
Pasos del método
Métodos automatizados
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La preparación de muestras es fundamental para realizar con éxito los análisis mediante HPLC y UHPLC. Estos son algunos ejemplos de preparación de muestras:

  • Conversión de muestras sólidas a su forma líquida
  • Simplificación de mezclas complejas
  • Eliminación de matrices de interferencia
  • Concentración o dilución

Se han establecido muchas técnicas de  preparación de muestras , y cada método tiene una ventaja en particular o una aplicación específica.

Método de preparación

Principio analítico

Aplicaciones

Dilución

Reducción de la concentración de matriz, disolvente o analito en la muestra

Prevención de sobrecarga de la columna y el detector, lo que reduce la fuerza de elución del disolvente de la muestra

Centrifugación

Sedimentación basada en la densidad

Eliminación de componentes celulares de gran tamaño de la solución

Filtración

Eliminación de partículas de la muestra

Ampliación de la vida útil de la columna, ya que se impide la obstrucción de los fluidos

Precipitación proteica

Precipitación de las proteínas al añadir sal, disolvente o mediante la alteración del pH

Eliminación de proteínas de la solución

Extracción líquido-líquido

Aislamiento de los componentes de la muestra en función de las diferencias de solubilidad de dos disolventes miscibles

Purificación de compuestos en base a la polaridad y/o carga

Extracción de fase sólida

Separación y purificación selectiva de analitos de interés mediante una fase estacionaria absorbente

Aislamiento de moléculas pequeñas de las matrices biológicas y desalinización de biomoléculas de gran tamaño

Captura por inmunoafinidad

Purificación selectiva de analitos mediante un anticuerpo

Aislamiento de moléculas pequeñas de las matrices biológicas, del medio ambiente y de alimentos y bebidas

Digestión de proteínas

Escisión enzimática de la proteína en péptidos

Generación de péptidos para proteómica bottom-up/mapeo de péptidos

Derivatización

Reacción química para alterar las propiedades fisicoquímicas del analito

Mejora de la retención, estabilidad o detectabilidad de los analitos

Exclusión por tamaños

Separación de los componentes de las muestras según su tamaño

Desalinización/intercambio de tampones de proteínas y eliminación de macromoléculas

Homogeneización

Descomposición de la estructura de una muestra sólida mediante fuerza mecánica

Alteración del tejido biológico y muestras medioambientales para una mejor extracción

QuEChERS

Proceso de varios pasos en el que se incluye la homogeneización, la extracción líquido-líquido, la centrifugación y la extracción de fase sólida

Extracción de pesticidas de muestras alimentarias y medioambientales

¿Qué es la matriz de la muestra?

Se puede considerar la matriz de la muestra cualquier elemento de la muestra excepto los analitos de interés. Esto incluye todo, desde las sales hasta otros compuestos y disolventes. El tipo de matriz puede dictar la preparación de la muestra, el modo de cromatografía y el método de detección. Entender la matriz de la muestra es fundamental para el desarrollo de un método.

¿Qué son los efectos de la matriz?

El efecto de matriz es un término amplio que describe la tendencia de las matrices de analitos específicos de alterar la detección o cuantificación de un analito. Este efecto generalmente se manifiesta en forma de sesgo y resulta en subestimación o sobreestimación de la concentración de analito existente en la solución.

Los efectos de la matriz pueden aparecer en casi cualquier fase del análisis, incluida la preparación de muestras, la separación en la columna y la detección. Estos son algunos ejemplos genéricos:

  • Elución simultánea de un compuesto absorbente de UV y el analito de interés
  • Alteración del factor de retención de analitos ionizables por el pH de la muestra
  • Supresión iónica del analito en la ionización por electrospray

Cómo mitigar la interferencia de la matriz

Existen algunas formas comunes de mitigar los efectos de la matriz. La elección correcta dependerá de las características específicas del análisis.

Si la sensibilidad del analito es la correcta, la forma más sencilla es diluir la muestra en un disolvente de inyección adecuado. Cuanto más diluida esté la muestra, menos se percibirá el impacto del efecto de la matriz.

Otras soluciones incluyen una extracción antes del análisis, lo que mejora la separación, ya que elimina posibles fuentes de contaminación de las muestras. El uso de una 2D-LC o el cambio a un método de detección más selectivo también puede evitar los efectos de la matriz.

Por último, puede realizar una adición estándar sin tener que cambiar el método. Sin embargo, esta técnica se suele evitar debido al aumento en el número de inyecciones por muestra. 

 

Pasos de desarrollo de un método

En situaciones en las que no se dispone de un método establecido, es necesario planificar y ejecutar los pasos con minuciosidad para desarrollar un procedimiento sólido. Aparte de la preparación de muestras, para crear un método de HPLC o UHPLC hay que conocer los cuatro pasos esenciales :

  1. Exploración de métodos. Implica la detección de varias condiciones de la columna y el eluyente. El propósito de esta fase es seleccionar las mejores combinaciones para realizar una correcta separación mediante HPLC. En la práctica, la exploración de métodos requiere una cantidad significativa de esfuerzo para el cambio manual de columnas y de fases móviles, así como para la creación de métodos con instrumentos. Si se conocen las propiedades del analito de interés, la exploración puede limitarse inicialmente a las columnas con más probabilidad de resultar adecuadas.

  2. Optimización del método. Incluye pruebas iterativas de varias condiciones de separación del método de HPLC y se realiza para lograr la mejor resolución, velocidad y reproducibilidad posible. Este paso es la parte que toma más tiempo en el desarrollo de métodos y a menudo requiere conocimientos expertos para realizarlo correctamente.

  3. Pruebas de solidez. Se realizan para determinar el impacto de los cambios en los parámetros del método de separación. La optimización de la solidez es importante para muchos procesos de validación y desarrollo de métodos. 

  4. Validación del método. Es el proceso específico del sector necesario para determinar si el método analítico que se ha desarrollado se ajusta a la aplicación deseada.

Desarrollo de métodos de HPLC de paso a paso

El desarrollo de un método de HPLC o UHPLC sólido, reproducible y fiable puede resultar complicado incluso para un cromatógrafo de líquidos con experiencia. Este vídeo le enseña todos los pasos necesarios para desarrollar correctamente un método de LC.

 

Consideraciones sobre el desarrollo de métodos

En el desarrollo de métodos hay tres parámetros que desempeñan un papel cada vez más relevante: retención de compuestos (k), eficacia (N) y selectividad (a). Una forma común de ajustar la selectividad es cambiar los eluyentes y la composición química . Si este cambio se realiza manualmente, dicho trabajo suele requerir mucho tiempo. Afortunadamente, la tecnología moderna permite la automatización de estos procesos.

Recursos para el desarrollo de métodos

El desarrollo de un método de HPLC o UHPLC sólido, reproducible y fiable puede resultar complicado incluso para un cromatógrafo de líquidos con experiencia. 

En algunos casos, puede evitar por completo el desarrollo de un método haciendo una búsqueda en la biblioteca Thermo Scientific AppsLab de aplicaciones analíticas. Esta biblioteca en línea contiene un repositorio en el que se pueden realizar búsquedas de miles de aplicaciones con información detallada de métodos y procedimientos eWorkflow™ completados previamente.

Otra fuente que puede ser útil para definir los parámetros del método inicial son las monografías de farmacopeas reconocidas, como la farmacopea estadounidense (USP) o la Farmacopea Europea.

Desarrollo automatizado de métodos

El desarrollo de un método de LC sigue constituyendo un reto en muchos laboratorios, pero el desarrollo automatizado de métodos es un proceso que ahorra tiempo y recursos de forma significativa. Hay varias herramientas de hardware y software disponibles para acelerar el proceso de desarrollo de métodos, mejorar la calidad del método final y reducir el tiempo de desarrollo desde semanas e incluso meses a tan solo unos días.

Hardware para el desarrollo de métodos

Las dos funciones claves del hardware para el desarrollo automatizado de métodos son:

  1. El cambio automático de disolventes. Esta tecnología proporciona la capacidad de cambiar entre fases móviles durante un ciclo sin necesidad de cambiar las botellas ni purgar el sistema de forma manual. Los sistemas de desarrollo de métodos Thermo Scientific Vanquish incluyen un kit de ampliación de disolventes con una válvula de selección externa para la exploración automatizada de hasta 10 disolventes por canal.

  2. El cambio automático de columnas. Se utiliza para las etapas iniciales del desarrollo de métodos y suele incluir la exploración de varias composiciones químicas de la fase estacionaria. El cambio automático de columnas ahorra tiempo y esfuerzo al usuario, puesto que elimina los periodos de inactividad en los que se tienen que cambiar manualmente los accesorios de una columna a otra. El kit de exploración de métodos Thermo Scientific Viper incluye todos los capilares y tubos de conexión para conexiones fluídicas necesarias para la exploración de la composición química de cuatro columnas.

    3.  

Software para el desarrollo de métodos

Un proceso de desarrollo de métodos totalmente automatizado requiere un software especializado para guiar el proceso desde la exploración hasta la validación de métodos. Muchos paquetes de software incluyen características desde la predicción del comportamiento de retención de los analitos hasta la generación de secuencias.

ChromSwordAuto Chromeleon Connect, por ejemplo, utiliza un enfoque con inteligencia artificial para la optimización de métodos. ChromSword AutoRobust Chromeleon Connect utiliza un enfoque multivariante para optimizar de forma automatizada la solidez de los métodos y la evaluación de la estabilidad del sistema. Las dos opciones están completamente integradas en Chromeleon para optimizar la experiencia del usuario.

Otro paquete de software destacado y compatible con los sistemas de HPLC Thermo Scientific es S-Matrix® Fusion QbD®, que se basa en gran medida en el enfoque de calidad basada en el diseño (QbD) para el desarrollo de métodos.

 
 
 
Preguntas frecuentes

¿Cuáles son los pasos en el desarrollo del método de HPLC?

Para desarrollar un método de HPLC se necesitan seguir cuatro pasos: exploración de métodos, optimización del método, pruebas de resistencia y validación del método.

¿Qué es la validación del método de HPLC?

La validación del método es un proceso formal y sistemático en el que se llevan a cabo procedimientos de investigación con el fin de verificar que el método de HPLC sea adecuado para proporcionar resultados satisfactorios y uniformes dentro de los límites establecidos para dicho método.

* Campo obligatorio

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