Produtos Dynabeads Streptavidin

Os produtos Dynabeads têm sido usados em todo o mundo em centenas de milhares de experimentos, citados em mais de 30.000 publicações, e estão presentes em inúmeras prateleiras de laboratório. A Dynabeads streptavidin é usada na purificação de células, isolamento de proteínas, captura de ácido nucleico e fluxos de trabalho de NGS.

Enriquecimento de alvo para NGS

Captura de células e de proteínas

Enriquecimento da sequência-alvo para NGS usando Dynabeads streptavidin

O sequenciamento de nova geração (NGS) começa com o isolamento do ácido nucleico

A primeira etapa no sequenciamento de nova geração (NGS) é o isolamento de ácido nucleico para a preparação da biblioteca. As quatro etapas principais para o sequenciamento de nova geração geralmente incluem a preparação da biblioteca, seguida da amplificação clonal, do sequenciamento da biblioteca e, finalmente, a análise de dados.

O sequenciamento de nova geração (NGS) como uma tecnologia de sequenciamento paralelo massivo e de alta produtividade permite o sequenciamento de DNA e RNA para o estudo da variação genética associada a doenças e outros processos biológicos. As aplicações incluem o sequenciamento do genoma completo, o sequenciamento profundo de regiões-alvo e a identificação de novos patógenos para promover o avanço de pesquisas microbianas e de doenças infecciosas.

O NGS revolucionou a análise genética e possibilitou novas aplicações em pesquisa genômica e clínica, saúde reprodutiva e ciência ambiental, agrícola e forense.

Enriquecimento de alvo por captura de hibridização para NGS

O enriquecimento do alvo por hibridização permite a captura e, portanto, cobertura suficiente de regiões genômicas de tipos de amostras degradadas, seja usando DNA, RNA ou DNA cell-free circulantes a partir do sangue.

O Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment se baseia na superfície sólida das esferas magnéticas. A captura de hibridização usa sondas de oligonucleotídeo biotinilado (iscas) que são complementares à sequência genética de interesse. As sondas biotiniladas imobilizam o oligonucleotídeo na superfície da esfera ligando com esferas revestidas com estreptavidina de 1 μm de diâmetro. As regiões-alvo isoladas e purificadas são subsequentemente amplificadas e preparadas para sequenciamento.

Figura 1. Enriquecimento de alvo no fluxo de trabalho de NGS

Figura 2. Captura de hibridização com esferas revestidas com estreptavidina

Solução de enriquecimento de alvo baseada em esferas para NGS

Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment oferece as seguintes vantagens:

Alta pureza– ajuda a minimizar ligações não específicas
Alta reprodutibilidade— produz resultados consistentes e pode ajudar a reduzir o risco de falhas
Alta sensibilidade– garante um fluxo de trabalho NGS bem-sucedido
Automação —permite o enriquecimento com alta produtividade

Os produtos Dynabeads revestidos com estreptavidina estão entre as esferas magnéticas mais publicadas no fluxo de trabalho de NGS e são recomendados por alguns dos maiores fornecedores de soluções para NGS.

Desempenho do Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment em um fluxo de trabalho de sequenciamento

A concentração medida das bibliotecas finais [Nm] para Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment (barra vermelha), um controle positivo e esferas magnéticas de estreptavidina de quatro outros fornecedores é mostrada (Figura 3). Todas as amostras foram preparadas em triplicata (n=3). A concentração das bibliotecas finais foi calculada com base na concentração dos fragmentos da biblioteca e na distribuição por tamanho. Para o sequenciamento de exoma a jusante, os critérios de aceitação foram definidos como 2,5 nM.

Figura 3. Concentração das bibliotecas finais.

A cobertura de sequenciamento de Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment (Figura 4, barra vermelha), um controle positivo e esferas magnéticas de estreptavidina dos 2 fornecedores que atenderam aos critérios de concentração de enriquecimento do alvo descritos na figura 3. A cobertura média é expressa como uma média das triplicatas; todas as amostras foram preparadas em triplicata (n=3). A barra de erro é o desvio padrão. O uso da Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment proporcionou a cobertura mais profunda (a maioria das leituras a partir das quais se pode estabelecer um consenso e a maior precisão).

Figura 4. Cobertura média.

A porcentagem da sequência de referência versus a profundidade de cobertura de Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment (Figura 5, barras vermelhas), um controle positivo e esferas magnéticas de estreptavidina dos 2 fornecedores que atenderam aos critérios de concentração de enriquecimento do alvo descritos na figura 3. Para Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment a 60x, 97,53% da referência é coberta com um mínimo de 60 leituras; esse desempenho de Dynabeads Streptavidin for Target Enrichment é particularmente importante para aplicações clínicas e identificação de variantes raras em que uma cobertura profunda (p. ex., 60x) é essencial.

Figura 5. Profundidade média de cobertura.

Dynabeads streptavidin para captura de proteínas e células

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Benefícios dos produtos Dynabeads Streptavidin

Reprodutibilidade absoluta
Baixa ligação de background
Alta sensibilidade
Facilmente automatizado
Sem centrifugação, precipitação ou filtragem—você só precisa de um imã
Robusto e suave, com cinética de ligação ideal
Poucas etapas de manuseio, sem diluição da amostra, perda mínima da amostra

Reprodutibilidade absoluta

Todos os produtos Dynabeads são produzidos com controle total de parâmetros como tamanho da esfera, área da superfície, teor de ferro e mobilidade magnética. A ausência de excesso de estreptavidina adsorvida fisicamente ajuda a garantir um vazamento insignificante e assegura uma variação mínima de lote para lote. As características uniformes e a reprodutibilidade incomparável dentro de um mesmo lote (CV <3%) e entre lotes ajudam a reduzir os custos associados aos testes de controle de qualidade (Figura 6). Seja para seu projeto de pesquisa ou para atividades de teste IVD, você pode confiar no desempenho consistente dos produtos Dynabeads.

Figura 6. Esferas magnéticas Dynabeads superparamagnéticas de tamanho médio. Cada esfera tem uma dispersão uniforme de material magnético, envolto em uma fina camada de polímero. Isso fornece uma superfície específica e definida para ligar o seu ligante. A verdadeira uniformidade de todas as esferas dentro de cada lote (CV típico <3%) fornece propriedades físicas e químicas consistentes. A reprodutibilidade incomparável entre lotes (CV típico <5%) permite a reprodutibilidade e a qualidade dos resultados.

Rápido e flexível

A Dynabeads streptavidin permite a captura instantânea e eficiente de moléculas biotiniladas por meio da cinética rápida da fase líquida. Isso aumenta a velocidade e a sensibilidade em comparação com filtros e abordagens baseadas em placas (Figura 7). Os produtos Dynabeads são verdadeiramente esféricos e têm uma grande área de superfície por unidade de volume. Isso permite uma alta e constante capacidade de ligação.

Figura 7. A cinética de ligação da Dynabeads streptavidin é superior às placas de microtitulação tradicionais. O gráfico mostra o % de ligação do fator de necrose tumoral (TNF) a anticorpos imobilizados em função do tempo. Cortesia do Dr. N-B Liabakk, Norwegian University of Science and Technology, Trondheim, Noruega.

Robusto e suave

Os produtos Dynabeads Streptavidin apresentam excelente estabilidade mecânica e química. Sem vazamento de ferro. Sem inibição da atividade enzimática. A monocamada de estreptavidina recombinante ajuda a garantir que a grande maioria dos locais de ligação de biotina fique estericamente disponível para ligação. A tecnologia também é muito suave, permitindo o isolamento de proteínas, bem como de complexos grandes ou instáveis. O estado nativo das proteínas é preservado e células frágeis permanecem viáveis. Volumes flexíveis podem ser usados, permitindo o isolamento de moléculas de baixa abundância. Uma alta relação sinal/ruído também contribui para o aumento da sensibilidade.

Fácil manuseio – manual ou automatizado

A separação magnética é surpreendentemente fácil. Sem centrifugação, precipitação, filtragem ou colunas tediosas. O manuseio magnético permite fácil lavagem, separação e concentração do seu alvo. A excelente capacidade de dispersão e a falta de remanência magnética tornam os produtos Dynabeads Streptavidin ideais tanto para protocolos manuais como automatizados, incluindo sistemas microfluídicos. Dependendo de sua aplicação específica e molécula-alvo, um método de captura direta ou indireta é aplicado.

Como funciona a captura de moléculas e células com esferas de estreptavidina

Quando usada em combinação com sonda/ligante biotinilado, qualquer molécula-alvo pode ser capturada nas Dynabeads acopladas à estreptavidina, isolada e manipulada posteriormente.

Captura direta ou indireta?

Dependendo da molécula-alvo e da aplicação específica, o método de captura direta ou indireta pode ser aplicado.

Para algumas aplicações, o uso de um ligante pré-acoplado para captura direta permite reutilizar Dynabeads e, assim, reduzir ainda mais os custos de preparação de amostras.

Uma abordagem indireta pode ser benéfica quando a concentração do seu alvo é baixa, a afinidade específica é fraca ou a cinética de ligação é lenta. Na abordagem indireta, a sonda/o ligante pode se ligar ao alvo em suspensão antes da adição das esferas.

Uma monocamada de estreptavidina é acoplada de forma covalente às Dynabeads, ajudando a garantir um vazamento desprezível que, de outra forma, poderia interferir no seu ensaio.

Com as esferas de estreptavidina e a capacidade de trabalhar com o KingFisher permitem que não haja etapas ou colunas de centrifugação.

As esferas magnéticas Dynabeads permitem aplicações de maior produtividade, para as quais as amostras podem ser processadas em placas de 24 ou 96 poços na família de instrumentos KingFisher.

Para baixar protocolos de estreptavidina, visite a biblioteca em thermofisher.com/kingfisherprotocols e personalize-os facilmente usando o software BindIt.

Além disso, para ver como KingFisher e Dynabeads são usados na nota de aplicação Sensibilidade de detecção de mutação em amostras de biópsia líquida e tecido FFPE correspondente.

Recursos, benefícios e aplicações