Marcadores de viabilidade fixáveis para Citometria de fluxo

Figura 1. Princípio das colorações de viabilidade fixáveis de células mortas LIVE/DEAD.O corante reativo de amina, impermeável à célula, se liga apenas à superfície da célula viva, resultando em fluorescência muito fraca. O corante pode penetrar na membrana celular em células mortas e se ligará a proteínas internas, resultando em fluorescência muito brilhante.

Figura 2. Retenção de colorações de viabilidade fixáveis LIVE/DEAD depois da fixação. O Kit de viabilidade LIVE/DEAD fixável vermelho (615) para excitação de 488 e 561nm foi usado para marcar diferencialmente uma mistura de células vivas (pico esquerdo) e células Jurkat tratadas com choque térmico (pico direito). As células em (A) não foram fixadas; as células em (B) foram fixadas em formaldeído a 3,7% depois da coloração. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo com excitação de 488 nm e emissão de aproximadamente 615 nm.

Figura 3. As células coradas com PI não retem o padrão de coloração após a fixação. Utilizou-se o Iodeto de Propídio (IP) para marcar diferencialmente uma mistura de células vivas (pico esquerdo) e células Jurkat tratadas com choque térmico (pico direito). As células em (A) não foram fixadas; as células em (B) foram fixadas em formaldeído a 3,7% depois da coloração. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo com excitação de 488 nm e emissão de aproximadamente 617 nm.

Etapa 1: Corar células com reagente LIVE/DEAD
Protocolo para marcação de células com LIVE/DEAD.
Minimize o FBS ou BSA ou o tampão de proteína para <1%

Etapa 2: Use um kit com solução de fixação e/ou permeabilização se estiver fazendo marcação intracelular ou para manter as células coradas por mais tempo. Não use um agente de fixação antes do reagente LIVE/DEAD.

Etapa 3: Marcar as células com anticorpos de citometria de fluxo.
Combinações de corantes e clones e reagentes podem ser criadas no Construtor de painéis de citometria de fluxo Invitrogen.
Protocolo para coloração intracelular para citometria de fluxo.

Figura 5. As células vivas terão menos fluorescência, pois o corante LIVE/DEAD se ligará às proteínas da superfície celular. As células mortas serão a população mais à direita e apresentarão um sinal mais brilhante, à medida que o corante LIVE/DEAD passa pelas membranas celulares danificadas e se liga às proteínas internas. A população média é a degradação estrutural das células e incorporará menos corante do que as células mortas. As células Jurkat foram incubadas por 20 minutos com o kit de viabilidade LIVE/DEAD Fixable Lime (506) para excitação de 405 nm e, em seguida, fixadas. As células mortas foram induzidas por tratamento de choque térmico.