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A capacidade de marcar células vivas com um corante de viabilidade e preservar esse padrão de marcação após a fixação é fundamental para a imunofenotipagem intracelular A exclusão de células mortas dos resultados permite uma separação mais limpa e a identificação das populações celulares. Os corantes de viabilidade fixáveis LIVE/DEAD Invitrogen são corantes de viabilidade fixáveis que ajudam a garantir uma avaliação precisa da viabilidade celular em amostras depois da fixação e/ou permeabilização.
Esses kits baseados em citometria de fluxo fornecem ferramentas que são:
Consulte também ensaios de viabilidade para formação de imagens por fluorescência e microplacas
Consulte o guia de seleção para obter informações sobre marcadores de viabilidade fixáveis
Esse webinar fornecerá uma visão geral dos métodos e dos reagentes para avaliar a viabilidade celular com citometria de fluxo. A discussão se concentrará em nossos esforços recentes para expandir a paleta de cores de corantes de viabilidade fixáveis.
LIVE/DEAD Fixable Viability Stain Kit baseia-se na reação de um marcador fluorescente com proteínas celulares (aminas). Esses corantes não podem penetrar em membranas celulares vivas e, portanto, apenas as proteínas da superfície celular estão disponíveis para reagir com o corante, resultando em uma coloração fraca (Figura 1, LIVE). O corante reativo pode permear as membranas danificadas das células mortas e corar as aminas interiores e exteriores, resultando em uma coloração mais intensa (Figura 1, DEAD).
Figura 1. Princípio das colorações de viabilidade fixáveis de células mortas LIVE/DEAD.O corante reativo de amina, impermeável à célula, se liga apenas à superfície da célula viva, resultando em fluorescência muito fraca. O corante pode penetrar na membrana celular em células mortas e se ligará a proteínas internas, resultando em fluorescência muito brilhante.
A diferença na intensidade da fluorescência entre as populações de células vivas e mortas é tipicamente superior a 50 vezes, permitindo assim uma discriminação completa e simultânea entre as duas populações de células (Figura 2A). Além disso, a fixação covalente dos corantes às proteínas permite a preservação da discriminação das populações de células vivas e mortas depois da fixação com formaldeído, comumente usada para imunofenotipagem intracelular e para inativar patógenos (Figura 2B). Em contraste, os corantes não fixáveis, incluindo o iodeto de propídio (IP ) (Figura 3), perdem o padrão de coloração depois da fixação
(Figura 3B).
Figura 2. Retenção de colorações de viabilidade fixáveis LIVE/DEAD depois da fixação. O Kit de viabilidade LIVE/DEAD fixável vermelho (615) para excitação de 488 e 561nm foi usado para marcar diferencialmente uma mistura de células vivas (pico esquerdo) e células Jurkat tratadas com choque térmico (pico direito). As células em (A) não foram fixadas; as células em (B) foram fixadas em formaldeído a 3,7% depois da coloração. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo com excitação de 488 nm e emissão de aproximadamente 615 nm.
Figura 3. As células coradas com PI não retem o padrão de coloração após a fixação. Utilizou-se o Iodeto de Propídio (IP) para marcar diferencialmente uma mistura de células vivas (pico esquerdo) e células Jurkat tratadas com choque térmico (pico direito). As células em (A) não foram fixadas; as células em (B) foram fixadas em formaldeído a 3,7% depois da coloração. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo com excitação de 488 nm e emissão de aproximadamente 617 nm.
Figura 4. Corantes LIVE/DEAD tem sobreposição minima de espectros e permitem experimentos maiores e mais precisos de citometria de fluxo. PBMCs humanos marcados com kit de viabilidade LIVE/DEAD Near IR (876), para excitação em 808nm. (No. Cat. L34981), CD4 Alexa Fluor 647 (No cat.51-0049-42) e CD8 APC-Cy7 (No cat. A15448). Todos com excitação por laser de 808 nm.
Etapa 1: Corar células com reagente LIVE/DEAD
Protocolo para marcação de células com LIVE/DEAD.
Minimize o FBS ou BSA ou o tampão de proteína para <1%
Etapa 2: Use um kit com solução de fixação e/ou permeabilização se estiver fazendo marcação intracelular ou para manter as células coradas por mais tempo. Não use um agente de fixação antes do reagente LIVE/DEAD.
Etapa 3: Marcar as células com anticorpos de citometria de fluxo.
Combinações de corantes e clones e reagentes podem ser criadas no Construtor de painéis de citometria de fluxo Invitrogen.
Protocolo para coloração intracelular para citometria de fluxo.
Figura 5. As células vivas terão menos fluorescência, pois o corante LIVE/DEAD se ligará às proteínas da superfície celular. As células mortas serão a população mais à direita e apresentarão um sinal mais brilhante, à medida que o corante LIVE/DEAD passa pelas membranas celulares danificadas e se liga às proteínas internas. A população média é a degradação estrutural das células e incorporará menos corante do que as células mortas. As células Jurkat foram incubadas por 20 minutos com o kit de viabilidade LIVE/DEAD Fixable Lime (506) para excitação de 405 nm e, em seguida, fixadas. As células mortas foram induzidas por tratamento de choque térmico.
Figura 6. Histogramas de células Jurkat coradas com diferentes corantes de viabilidade LIVE/DEAD. A população de células mortas foi criada com tratamento de choque térmico. As amostras celulares foram marcadas por 20 min com corantes LIVE/DEAD fixáveis.
Corante LIVE/DEAD Fixable Blue | LIVE/DEAD Corante Fixable Violet | Corante LIVE/DEAD Fixable Lime | Corante LIVE/DEAD Fixable Aqua | Corante LIVE/DEAD Fixable Yellow | ||
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Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | |||||
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | |||||
Laser (nm) | UV | 405 | 405 | 405 | 405 | |
Ex/Em (nm) | 350/450 | 416/451 | 405/506 | 367/526 | 400/575 | |
Bibliografia |
Citações
| |||||
Multiplexável |
Sim
|
Sim
| Sim |
Sim
|
Sim
| |
Compatibilidade com corante | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como Indo-1 (azul), DAPI ou Hoechst 33342 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como os corantes Pacific blue, CellTrace Violet, FxCycle Violet,, BV421 ou eFluor 450 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como eFluor 506 e Pacific Orange | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como os corantes Pacific Green, ensaio de apoptose F2N12S, AmCyan ou BV510 . | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen,como os corantes Pacific Orange, Qdot 605, o ensaio de apoptose F2N12S, ou BV605 | |
Fixável |
Sim
|
Sim
| Sim |
Sim
|
Sim
| |
Tipo de amostra |
Células vivas
| |||||
Nº Cat. | 80 testes | L34989 | ||||
200 testes | L34990 | |||||
400 testes | L34991 |
Corante LIVE/DEAD Fixable Green | Corante LIVE/DEAD Fixable Olive | Corante LIVE/DEAD Fixable Orange | Corante LIVE/DEAD Fixable Red | |||
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Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | |||||
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | |||||
Laser (nm) | 488 | 488 | 561 | 488 | 561 | |
Ex/Em (nm) | 495/520 | 480/557 | 580/602 | 595/615 | ||
Bibliografia |
Citações
| |||||
Multiplexável |
Sim
| Sim | Sim |
Sim
| ||
Compatibilidade com corante | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como corantes FITC, Alexa Fluor 488, GFP ou CellTrace CSFE | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como FITC, Alexa Fluor 488, Nova Fluor Blue 510, GFP, LIVE/DEAD Fixable Green ou corante CellTrace CSFE | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como PE-Alexa Fluor 610 PE-eFluor 610, PE-Texas Red e NovaFluor Blue 610 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como R-PE, iodeto de propídio, corante CYTOX AADvanced STEAM, 7-AAD, PE-Alexa Fluor 610 e PE-Texas Red tandems | ||
Fixável |
Sim
| Sim | Sim |
Sim
| ||
Tipo de amostra |
Células vivas
| |||||
Nº Cat. | 80 testes | L34977 | L34983 | |||
200 testes | L34978 | L34984 | ||||
400 testes | L34979 | L34985 |
Corante LIVE/DEAD Fixable Red | Corante LIVE/DEAD Fixable Scarlet | Corante LIVE/DEAD Fixable Near-IR (775) | Corante LIVE/DEAD Fixable Near-IR (780) | ||
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Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | ||||
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | ||||
Laser (nm) | 633/635 | 633/635 | 633/635 | 633/780 | |
Ex/Em (nm) | 650/665 | 702/723 | 750/775 | 633/785 | |
Bibliografia | |||||
Multiplexável |
Sim
| Sim | Sim |
Sim
| |
Compatibilidade com corante | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como APC, Alexa Fluor 647, FxCycle Far Red e CellTrace Far Red. | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como Alexa Fluor 700, APC-Cyanine 5.5, NovaFluor Red 700 e DRAQ5 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como APC-Alexa Fluor 750, APC-Cy 7 ou o corante rubi Vybrant DyeCycle | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como APC-Alexa Fluor 750 e APC-eFluor 780 | |
Fixável | Sim | Sim | Sim | Sim | |
Tipo de amostra |
Células vivas
| ||||
Nº Cat. | 80 testes |
L34973
| L34986 | L34975 | L34992 |
200 testes |
L10120
| L34987 |
L10119
| L34993 | |
400 testes |
L34974
| L34988 | L34976 | L34994 |
278_Corante LIVE/DEAD Fixable NEar IR (876) | ||
---|---|---|
Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | |
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | |
Laser (nm) | 808 | |
Ex/Em (nm) | 840/876 | |
Multiplexável |
Sim
| |
Compatibilidade com corante | — | |
Fixável |
Sim
| |
Tipo de amostra |
Células vivas
| |
Nº Cat. | 80 testes | |
200 testes | ||
400 testes |
Corante LIVE/DEAD Fixable Blue | LIVE/DEAD Corante Fixable Violet | Corante LIVE/DEAD Fixable Lime | Corante LIVE/DEAD Fixable Aqua | Corante LIVE/DEAD Fixable Yellow | ||
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Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | |||||
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | |||||
Laser (nm) | UV | 405 | 405 | 405 | 405 | |
Ex/Em (nm) | 350/450 | 416/451 | 405/506 | 367/526 | 400/575 | |
Bibliografia |
Citações
| |||||
Multiplexável |
Sim
|
Sim
| Sim |
Sim
|
Sim
| |
Compatibilidade com corante | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como Indo-1 (azul), DAPI ou Hoechst 33342 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como os corantes Pacific blue, CellTrace Violet, FxCycle Violet,, BV421 ou eFluor 450 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como eFluor 506 e Pacific Orange | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como os corantes Pacific Green, ensaio de apoptose F2N12S, AmCyan ou BV510 . | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen,como os corantes Pacific Orange, Qdot 605, o ensaio de apoptose F2N12S, ou BV605 | |
Fixável |
Sim
|
Sim
| Sim |
Sim
|
Sim
| |
Tipo de amostra |
Células vivas
| |||||
Nº Cat. | 80 testes | L34989 | ||||
200 testes | L34990 | |||||
400 testes | L34991 |
Corante LIVE/DEAD Fixable Green | Corante LIVE/DEAD Fixable Olive | Corante LIVE/DEAD Fixable Orange | Corante LIVE/DEAD Fixable Red | |||
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Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | |||||
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | |||||
Laser (nm) | 488 | 488 | 561 | 488 | 561 | |
Ex/Em (nm) | 495/520 | 480/557 | 580/602 | 595/615 | ||
Bibliografia |
Citações
| |||||
Multiplexável |
Sim
| Sim | Sim |
Sim
| ||
Compatibilidade com corante | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como corantes FITC, Alexa Fluor 488, GFP ou CellTrace CSFE | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como FITC, Alexa Fluor 488, Nova Fluor Blue 510, GFP, LIVE/DEAD Fixable Green ou corante CellTrace CSFE | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como PE-Alexa Fluor 610 PE-eFluor 610, PE-Texas Red e NovaFluor Blue 610 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como R-PE, iodeto de propídio, corante CYTOX AADvanced STEAM, 7-AAD, PE-Alexa Fluor 610 e PE-Texas Red tandems | ||
Fixável |
Sim
| Sim | Sim |
Sim
| ||
Tipo de amostra |
Células vivas
| |||||
Nº Cat. | 80 testes | L34977 | L34983 | |||
200 testes | L34978 | L34984 | ||||
400 testes | L34979 | L34985 |
Corante LIVE/DEAD Fixable Red | Corante LIVE/DEAD Fixable Scarlet | Corante LIVE/DEAD Fixable Near-IR (775) | Corante LIVE/DEAD Fixable Near-IR (780) | ||
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Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | ||||
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | ||||
Laser (nm) | 633/635 | 633/635 | 633/635 | 633/780 | |
Ex/Em (nm) | 650/665 | 702/723 | 750/775 | 633/785 | |
Bibliografia | |||||
Multiplexável |
Sim
| Sim | Sim |
Sim
| |
Compatibilidade com corante | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como APC, Alexa Fluor 647, FxCycle Far Red e CellTrace Far Red. | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como Alexa Fluor 700, APC-Cyanine 5.5, NovaFluor Red 700 e DRAQ5 | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como APC-Alexa Fluor 750, APC-Cy 7 ou o corante rubi Vybrant DyeCycle | Não pode ser usado em combinação com a linha de produtos Invitrogen, como APC-Alexa Fluor 750 e APC-eFluor 780 | |
Fixável | Sim | Sim | Sim | Sim | |
Tipo de amostra |
Células vivas
| ||||
Nº Cat. | 80 testes |
L34973
| L34986 | L34975 | L34992 |
200 testes |
L10120
| L34987 |
L10119
| L34993 | |
400 testes |
L34974
| L34988 | L34976 | L34994 |
278_Corante LIVE/DEAD Fixable NEar IR (876) | ||
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Base do ensaio | Os kits de corantes de células mortas fixáveis LIVE/DEAD são corantes de viabilidade fixáveis que distinguem as células vivas das células mortas com base na integridade da membrana celular e no acesso às aminas disponíveis. As células podem então ser fixadas para detecção de antígenos intracelulares sem perda do padrão de coloração celular original. Permite a fácil exclusão de células mortas da leitura da citometria de fluxo. | |
Leitura | As células mortas são altamente fluorescentes e fáceis de distinguir das células vivas, que são coradas com fluorescência mínima | |
Laser (nm) | 808 | |
Ex/Em (nm) | 840/876 | |
Multiplexável |
Sim
| |
Compatibilidade com corante | — | |
Fixável |
Sim
| |
Tipo de amostra |
Células vivas
| |
Nº Cat. | 80 testes | |
200 testes | ||
400 testes |
Não tem certeza sobre qual corante se adequa às suas necessidades, ou precisa de ainda mais flexibilidade em seus experimentos? Experimente nosso kit de amostra de corante de células mortas fixável LIVE/DEAD, que contém uma quantidade suficiente do corante de cada cor para realizar 40 testes.
O kit Invitrogen ArC Amine Reactive Compensation Bead fornece uma técnica consistente, precisa e simples de usar para o ajuste da compensação de citometria de fluxo ao usar qualquer um dos kits de corante de células mortas fixáveis LIVE/DEAD ou qualquer corante reativo à amina. Não há necessidade de tratamento de choque térmico das células.
Figura 3. As esferas do Kit ArC Beads foram coradas com corantes de células mortas LIVE/DEAD Fixable Violet (V34955) e analisadas por citometria de fluxo. Uma mistura de esferas positivas e negativas no kit de esferas ArC (A 10346) foi corada com o corantes de células mortas LIVE/DEAD Fixable Violet (V34955), lavada e analisada usando citometro de fluxo equipado com um laser de 405/7 nm com filtro Band-Pass de 450/50 nm. O histograma mostra picos positivos e negativos claramente distinguíveis.
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