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Corante para gel de DNA mais seguro e sensível
O Invitrogen SYBR Safe DNA Gel Stain é um corante altamente sensível para a visualização do DNA em géis de agarose ou acrilamida. O corante SYBR Safe foi especificamente formulado para ser uma alternativa menos perigosa ao brometo de etídio que pode ser usado para visualização em luz azul ou UV.
O corante SYBR Safe é fornecidao como um concentrado ou em uma solução pronta para uso que pode ser usada de forma semelhante a uma solução de brometo de etídio. O corante também é adequado para coloração de RNA em géis.
Mais colônias a partir de sua clonagem
Nossos cientistas demonstraram uma ampla melhora na eficiência de clonagem de fragmentos de DNA corados com o corante SYBR Safe e visualizados usando o Invitrogen Safe Imager Blue-Light Transilluminator em comparação com os mesmos fragmentos corados com brometo de etídio e expostos à luz UV.
Obtenha maior eficiência na clonagem com o uso de enzimas de restrição
Foi realizada a dupla digestão do vetor plasmidial Invitrogen pCMV•SPORT-βgal com EcoRI e HindIII para criar dois fragmentos de DNA com extremidades coesivas: o inserto com o gene lacZ (3.536 bp) e o vetor (4.318 bp). Quantidades iguais de DNA digerido foram submetidas a eletroforese em géis de agarose a 1%. Os géis foram corados com brometo de etídio (0,5 mg/mL em TBE) ou corante de DNA SYBR Safe(diluição de 1:10.000 em TBE) por 15 minutos e, em seguida, visualizados usando um transiluminador UV ou o transiluminador de luz azul Safe Imager, respectivamente. Após os tempos de exposição definidos, os dois fragmentos de DNA foram excisados dos géis e purificados usando o Kit Invitrogen PureLink Gel Extraction Kit. (nome do produto) Fragmentos de DNA controle foram corados, mas não expostos ao transiluminador. vetor foram religados com o uso da Invitrogen T4 DNA Ligase, foram usados para transformação química de células Invitrogen UltraMax DH5α-FT e plaqueados em placas de seleção. O número total de colônias azuis e brancas foi contado para avaliar a eficiência da clonagem. Cada experimento foi conduzido em triplicata, e determinou-se a eficiência média da clonagem.
O número total de colônias nas placas de brometo de etídio/UV foi significativamente inferior ao das placas SYBR Safe/Safe Imager, mesmo nos primeiros pontos temporais(Figura 1). Ao longo dos vários pontos temporais obtidos, o número de colônias viáveis no conjunto de placas de brometo de etídio/UV caiu de cerca de 15.000 colônias para menos de 500 colônias, representando uma redução de cerca de 30 vezes na eficiência da clonagem. Por outro lado, as placas do conjunto SYBR Safe/Safe Imager mantiveram um nível de colônias próximo ao do controle (>12.500) em todos os pontos temporais, incluindo o ponto de 120 segundos.
Figura 1. Maior eficiência na clonagem com uso de enzimas de restrição. O fragmento do inserto com o gene lacZ o vetor pCMV•SPORT-βgal foram submetidos a eletroforese em géis de agarose duplicados e corados com o corante de gel de DNA SYBR Safe ou com brometo de etídio. Os fragmentos de DNA foram então visualizados por períodos definidos utilizando o transiluminador de luz azul do Safe Imager ou um transiluminador UV, respectivamente. As bandas de DNA do inserto do vetor foram excisadas dos géis, ligadas,usadas para transformação química de bactérias competentes e plaqueadas em placas ampicilina-X-gal (placas representativas mostradas no painel A). A eficiência da clonagem foi determinada com base no número total de colônias azuis e brancas presentes (B). Os dados plotados refletem uma média de três experimentos.
Beneficie-se da eficiência de clonagem aprimorada com Gateway
No experimento, um gene de 1,25 kb foi amplificado por PCR. Sete quantidades iguais do produto PCR foram submetidas a eletroforese em géis de agarose duplicados; um gel foi visualizado com corante de gel de DNA SYBR Safe luz azul, enquanto o outro gel foi visualizado com brometo de etídio e luz UV. As bandas foram excisadas após tempos de exposição definidos; os produtos, foram purificados usando o PureLink Gel Extraction Kit e depois usados em uma reação de clonagem Invitrogen Gateway BxP. Uma parte de cada reação foi usada para transformar bactérias quimicamente competentes Invitrogen One Shot TOP10; e três diluições em série foram plaqueadas. Os resultados mostraram uma redução de 80% no número de colônias após apenas 30 segundos de exposição a brometo de etídio/UV (Figura 2). Após apenas 2 minutos de exposição, a contagem de colônias foi quase zero. Por outro lado, a eficiência de clonagem obtida com corante de gel de DNA SYBR Safe e transiluminador de luz azul do Safe Imager permaneceu em praticamente 100% do valor controle durante todo o período do experimento.
Figura 2. Maior eficiência de clonagem com gateway. Um gene de 1,25 kb foi amplificado por PCR usando primers attB1 e attB2, e frações equivalentes foram separadas em géis de agarose duplicados. Os géis foram corados com coloração de gel de DNA SYBR Safe ou brometo de etídio, e os fragmentos de DNA foram visualizados com o transiluminador de luz azul do Safe Imager ou com um transiluminador UV, respectivamente. Os produtos PCR foram clonados pela recombinação Gateway BP e transformados em bactérias quimicamente competentes. Três diluições seriais foram plaqueadas, as colônias foram contadas.
Conclusão
O uso da coloração de gel de DNA SYBR Safe e do transiluminador de luz azul do Safe Imager melhora significativamente a eficiência da clonagem tanto em enzimas de restrição quanto com o sistema de clonagem Gateway.
Safe Imager Blue-Light Transilluminator
Elimine as preocupações de segurança da transiluminação UV
- Não danifica a pele e os olhos
- Produz luz mais brilhante e emissão mais uniforme do que as fontes convencionais de luz azul
- Fornece excitação ideal para corante de gel de DNA SYBR Safe
- Otimizado para uso com outros corantes de ácido nucleico e proteína Invitrogen, como os corantes SYBR Gold, SYBR Green I & II, SYPRO Ruby, SYPRO Orange e Coomassie Fluor Orange
Especificações do instrumento
- Dimensões gerais: 28 × 31 × 7 cm (11 × 12,25 × 2,75 pol.)
- Dimensões da superfície de visualização: 20 × 20 cm (7,87 × 7,87 pol.)
- Fonte de luz: diodos emissores de luz (LEDs) produzindo um pico de emissão estreito centralizado a aproximadamente 470 nm
- Vida útil do LED: 100.000 horas
- Acessórios incluídos: unidade de filtro âmbar, óculos de visualização e cabo elétrico.
 | Avaliação da mutagenicidade e da segurança ambiental: Corante de gel de DNA SYBR Safe |
Ensaio para transformação morfológica em culturas primárias
Um laboratório independente investigou a capacidade de corante de gel de DNA SYBR Safe para induzir um aumento na transformação morfológica de células de embrião de hamster sírio (SHE), em relação às culturas de controle de veículos, após um período de exposição de 7 dias. Nenhum dos três grupos de tratamento (0,0500, 0,150 e 0,300 µg/mL) induziu um aumento significante na transformação morfológica em comparação com o controle veículo correspondente. Além disso, um aumento significativo da frequência de transformação morfológica também foi obtido a partir do tratamento de controle positivo com benzopireno a 5,0 mg/mL. O artigo de teste (corante de gel de DNA SYBR Safe) foi, portanto, avaliado como negativo no ensaio de triagem de transformação de células SHE sob condições de exposição de 7 dias deste estudo.
Conclusão: a corante de gel de DNA SYBR Safe não induz transformações em culturas primárias de células de embrião de hamster sírio (SHE) quando comparado com solvente sozinho, indicando fortemente que a corante de gel de DNA SYBR Safe é não carcinogênico. Por outro lado, o brometo de etídio testa positivo no ensaio de SHE, consistente com sua atividade conhecida como mutagênico forte.
Ensaios para aberrações cromossômicas e mutações para frente
Um laboratório independente investigou a capacidade do corante de gel de DNA SYBR Safe de induzir aberrações cromossômicas em linfócitos do sangue periférico cultivados com e sem ativação metabólica exógena. Nenhum aumento significativo no número de células com aberrações estruturais, poliploidia ou endorreduplicação foi observado no teste com ou sem ativação S9. Da mesma forma, não foram observados aumentos na frequência mutante que excederam os critérios mínimos nas células L5178Y TK+/- de linfoma de camundongo.
Conclusão: O corante de gel de DNA SYBR Safe não causa mutações nas células de linfoma de camundongo no locus TK, nem induz aberrações cromossômicas em linfócitos linfócitos de sangue periférico humano cultivados, com ou sem ativação metabólica S9, usando testes padronizados em comparação com controles apropriados.
Dados resumidos: análise de genotoxicidade de mamíferos de corante de gel de DNA SYBR Safe
| Teste in vitro* | Tipo de célula | Resultado com ativação S9† | Resultado sem ativação S9† |
|---|---|---|---|
| Transformação1 | Células embrionárias de hamster sírio (SHE) | NA | Negativo |
| Aberrações cromossômicas2 | Linfócitos de sangue periférico humano cultivados | Negativo | Negativo |
| Mutação para frente3,4 | Células de linfoma de camundongo L5178YTK+/- | Negativo | Negativo |
* Testes in vitro foram realizados pela Covance Laboratories Inc., Vienna, VA. † Fração de S9 de mamífero obtida de fígado de rato induzido por Aroclor 1254. NA = Não aplicável. 1Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 356, 1 (1996); 2Evans, H.J., in Chemical Mutagens, Principles and Methods for Their Detection, A. Hollaender, Ed., Vol. 4, (1976) pp. 129; 3Mutation Res 72, 447 (1980); 4Mutation Res 59, 61 (1979).
Ensaio para mutações reversas (teste de Ames)
As amostras foram pré-tratadas com fração S9 de mamífero e, em seguida, testadas. Nas cepas TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium, um aumento das mutações reversas de mais de duas vezes em relação ao basal indica um resultado positivo para a mutagenicidade neste teste. Nas cepas TA1535, TA1537 e TA1538, um aumento de mais de três vezes nas mutações reversas em relação ao basal indica um resultado positivo.
Conclusão: em comparação com o brometo de etídio, a corante de gel de DNA SYBR Safe provoca menos mutações no teste padrão de Ames, conforme medido em várias cepas diferentes de Salmonella typhimurium. Resultados fracamente positivos para o corante de gel de DNA SYBR Safe neste teste ocorreram em quatro de sete cepas e somente com ativação por uma fração S9 de mamíferos (veja a figura).
Ensaio de toxicidade oral
Uma única administração oral de corante de gel de DNA SYBR Safe em 0,5X TBE a uma dose limite de 5.000 mg/kg em três ratas não produziu mortalidades ou sinais de toxicidade. O procedimento foi concebido para determinar a toxicidade oral aguda do material em teste. Um teste de triagem de limite foi realizado com três ratas Sprague Dawley, que receberam uma dose limite oral de 5.000 mg/kg de corante de gel de DNA SYBR Safe. Os animais foram observados quanto a mortalidade, mudança de peso e sinais de toxicidade por um período de duas semanas. Como as três ratas sobreviveram por duas semanas após a administração da dose, o LD50 para o artigo de teste foi considerado maior que a dose limite e não foi necessário nenhum teste adicional.
Conclusão: uma única administração oral de corante de gel de DNA SYBR Safe não produz sinais de mortalidade ou toxicidade na dose limite de 5.000 mg/kg.
Dados resumidos: toxicidade oral
| Análise | Método | Resultados |
|---|---|---|
| Toxicidade aquática* | Triagem aguda de varião de cabeça grande (Pimephales promelas) CA Title 22 | Não é perigoso ou tóxico para a vida aquática |
| Toxicidade oral** | Teste de toxicidade oral aguda de EPA OPPTS 870.1100 | LD50 > 5000 mg/kg |
* Realizado por AMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory, San Diego, CA.
** Realizado por Northview Pacific Laboratories, Inc., Hercules, CA.
 | Resultados de impacto ambiental (EUA)Com base em testes abrangentes de segurança ambiental, o corante de gel de DNA SYBR Safe não é classificado como resíduo perigoso de acordo com as regulamentações federais dos EUA, como RCRA (Resource Conservation and Recovery Act, Lei de conservação e recuperação de recursos). O corante de gel de DNA SYBR Safe atende aos requisitos do Clean Water Act (Lei de águas limpas) e do NPDES (National Pollutant Discharge Elimination System, Sistema nacional de eliminação de descargas de poluentes). |
Conclusões
- O corante de gel de DNA SYBR Safe não é classificado como corrosivo, inflamável ou reativo de acordo com as diretrizes da EPA (Environmental Protection Agency, Agência de proteção ambiental) (Tabela 1).
- O corante de gel de DNA SYBR Safe não difere significativamente da solução tampão 0,5X TBE quando testado de acordo com as diretrizes do NPDES (National Pollutant Discharge Elimination System, Sistema nacional de eliminação de descargas de poluentes) (Tabela 2).
- O corante de gel de DNA SYBR Safe em 0,5X TBE é indistinguível de 0,5X TBE isoladamente em termos de teor de poluentes orgânicos. Ambas as amostras testaram negativas para a presença de uma extensa gama de compostos orgânicos (Tabela 3).
Tabela 1. Análise de resíduos perigosos do corante de gel de DNA SYBR Safe.
| Análise* | Método | Resultados |
|---|---|---|
| Corrosividade | EPA 150.1 | Não corrosivo (pH = 8,25) |
| Corrosividade (por Corrositex) | DOT-E 10904 | Categoria 2 não corrosivo |
| Capacidade de ignição | EPA 1010 | Não inflamável (<100 °C) |
| Reatividade | EPA 9010B/9030A | Nenhuma reatividade detectada |
* Todos os testes foram realizados por AMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory, San Diego, CA.
Tabela 2. Corante de gel de DNA SYBR Safe: visão geral da análise de NPDES*.
| Teste | Corante SYBR Safe em 0,5X TBE | 0,5X TBE |
|---|---|---|
| PH (150,1) | 8,45 | 8,48 |
| Cianeto total (335,2) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Demanda química de oxigênio (DQO; 410,1) | 7020 | 6840 |
| Amônia como nitrogênio (350,1) | 253 | 248 |
| Carbono orgânico total (415,1) | 2480 | 2360 |
| Fenólicos totais (420,1) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Pesticidas organoclorados e PCBs (608M) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Compostos orgânicos semivoláteis (625) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Compostos orgânicos voláteis (624) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Metais poluentes prioritários (Sb, As, Be, Cd, Cr, Cu, Pb, Hg, Ni, Se, Ag, Tl, Zn) (série EPA 200.7/200) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
* Todos os testes foram realizados por Columbia Analytical Services, Inc., Kelso, WA. Os métodos utilizados foram os descritos no CFR (Code of Federal Regulations, Código de Regulamentos Federais) Título 40, Parte 136.
Tabela 3. Corante de gel de DNA SYBR Safe: análise detalhada de compostos orgânicos*.
| Pesticidas organoclorados e PCBs (608M) | ||||
| alfa-BHC | beta-BHC | gama-BHC | delta-BHC (lindano) | Heptacloro |
| Aldrina | Heptacloro epóxido | Endosulfan | Dieldrina | 4,4'-DDE |
| Endrina | Endossulfno II | 4,4'-DDD | Aldeído endrina | Sulfato de endosulfan |
| 4,4'-DDT | Toxafeno | Clordano | Aroclor 1016 | Aroclor 1221 |
| Aroclor 1232 | Aroclor 1242 | Aroclor 1248 | Aroclor 1254 | Aroclor 1260 |
| Etilbenzeno | Bromofórmio | 1,1,2,2,-Tetracloro etano | 1,3-Dicloro benzeno | |
| Compostos orgânicos voláteis (624) | ||||
| Clorometano | Cloreto de vinil | Bromometano | Cloroetano | Triclorofluoro metano |
| 1,1-Dicloroeteno | Cloreto de metileno | trans-1,2-Dicloroeteno | 1,1-Dicloroetano | Clorofórmio |
| 1,1,1-Tricloroetano (TCA) | Tetracloreto de carbono | Benzeno | 1,2-Dicloroetano (EDC) | Tricloroeteno (TCE) |
| 1,2-Dicloropropano | Bromodicloro metano | 2-Éter cloroetilo vinílico | trans-1,3-Dicloro- propeno | Tolueno |
| cis-1,3-Dicloro propeno | 1,1,2-Tricloroetano | Tetracloroeteno (PCE) | Dibromocloro metano | Clorobenzeno |
| 1,4-Diclorobenzeno | 1,2-Diclorobenzeno | Acroleína | Acrilonitrila | |
| Compostos orgânicos semivoláteis (625) | ||||
| N-Nitrosodimetil- amina | Éter dicloroetílico ou Bis (2-cloroetil) éter | Fenol | 2-Clorofenol | Éter di-isopropílico |
| Hexacloroetano | N-Nitrosodi-n-propil- amina | Nitrobenzeno | Isoforona | 2-Nitrofenol |
| 2,4-Dimetilfenol | 4-Nitrofenol | 2,4-Diclorofenol | 1,2,4-Triclorobenzeno | Naftaleno |
| Hexaclorobutadieno | 4-Cloro-3-metilfenol | Hexaclorociclo- pentadieno | 2,4,6-Triclorofenol | 2-Cloronap 2-Cloronaftaleno |
| Acenaftileno | Dimetil ftalato | 2,6-Dinitrotolueno | Acenafteno | 2,4-Dinitrofenol |
| Bis (2-cloroetóxi) metano | 2,4-Dinitrotolueno | Fluoreno | Dietil ftalato | 2-Metil-4,6-dinitrofenol |
| N-Nitrosodifenil amina | 4-Bromofenil fenil éter | Hexaclorobenzeno | Pentaclorofenol | Fenantreno |
| Antraceno | Di-n-butil ftalato | Fluoranteno | Benzidina | Pireno |
| Butil benzil ftalato | 3,3'-Diclorobenzidina | Benzo (a)antraceno | Criseno | Bis(2-etilhexil) ftalato |
| Di-n-octil ftalato | Benzo(b)fluoranteno | Benzo(k)fluoranteno | Benzo(a)pireno | Indeno(1,2,3-cd)pireno |
| Dibenzo(a,h)antraceno | Benzo(g,h,i)perileno | 1,2-Difenilidrazina | 2,3,7,8-Tetracloro- dibenzo-p-dioxina | 4-Clorofenil fenil éter |
As amostras analisadas foram 0,5X TBE e 0,5X TBE + 1X corante de gel de DNA SYBR Safe; nenhum dos compostos listados na tabela foi detectado em qualquer amostra. Os testes foram realizados por Columbia Analytical Services, Inc., Kelso, WA. Os métodos utilizados foram os descritos no CFR (Code of Federal Regulations, Código de Regulamentos Federais) Título 40, Parte 136.
Ligado a ácidos nucleicos, o corante SYBR Safe tem o máximo de excitação de fluorescência a 280 e 502 nm e o máximo de emissão a 530 nm. O DNA corado pode ser visualizado e analisado utilizando sistemas de geração de imagens equipados com uma fonte de excitação na faixa UV ou entre 470 nm e 530 nm.
Recomendações de filtro para uso com corante de gel de DNA SYBR Safe
A tabela abaixo lista os filtros recomendados para sistemas específicos de documentação de gel. Se o seu sistema não estiver listado, entre em contato com o fabricante para obter recomendações. Observe que os espectros de excitação e emissão do corante de gel de DNA SYBR Safe são muito semelhantes aos dos corantes SYBR Green I, SYBR Green II e SYBR Gold, bem como da fluoresceína (FITC). Portanto, filtros apropriados para esses corantes também podem ser usados. Não é necessário um filtro de câmera com o transiluminador de luz azul do Safe Imager; o filtro âmbar fornecido com o instrumento serve para esse fim.
| Instrumento | Fabricante | Fonte de excitação | Filtro de emissão |
|---|---|---|---|
| Câmera Polaroid® | Polaroid® | UV | Filtro fotográfico Invitrogen™ SYBR™ Safe (Cat. N° S37100) |
| FCR-10 | Polaroid® | UV | #3-4218 |
| AlphaImager | Alpha Innotech | 302 nm | SYB-500 |
| AlphaDigiDoc RT | Alpha Innotech | Transiluminador UV | |
| Cobertura, suporte da câmera | Alpha Innotech | Transiluminador UV | |
| Gabinete de luz DE500 ou DE400 com 2,17" de diâmetro. | Alpha Innotech | Transiluminador UV | SYB-100 |
| Gabinete de luz DE500 ou DE400 com 2" de diâmetro. | Alpha Innotech | Transiluminador UV | SYB-500 |
| VersaDoc Imaging Systems | Bio-Rad | Broadband UV | 520LP |
| Molecular Imager FX Systems | Bio-Rad | 488 nm | 530 DF 30 |
| Sistemas Gel Doc | Bio-Rad | 302 nm | 520DF30 (#170-8074)† |
| Typhoon 9400/9410 | GE Healthcare | 488 nm | 520 BP 40 |
| Typhoon 9200/9210/8600/8610 | GE Healthcare | 488 nm | 526 SP |
| FluorImager | GE Healthcare | 488 nm | 530 DF 30 |
| Storm | GE Healthcare | Azul (modo de fluorescência) | |
| ImageMaster VDS-CL | GE Healthcare | Transmissão | UV baixo |
| UltraCam/gerador de imagens de gel | Ultra-Lum | UV | Filtro amarelo (#990-0804-07)† |
| Omega Systems | Ultra-Lum | UV | 520 nm |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#60-2034)† |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#62-4289)† |
| FOTO/Analyst Minivisionary | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#62-2535)† |
| FOTO/Analyst Apprentice | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#60-2056)† |
| FUJI FLA-3000 | FUJI Film | 473 nm | 520LP |
| BioDocIt/AC1/EC3/BioSpectrum | UVP | 302 nm | SYBR Green (#38-0219-01)† ou SYBR Gold (#38-0221-01)† |
| Gel Logic | Kodak | UV 535 | 535 nm WB50 |
| Mini BIS/Mini BIS Pro | DNR Bioimaging | UV 320 | Amarelo |
| Compact BIS | DNR Bioimaging | UV 320 | Laranja |
| Syngene Instruments | Syngene | UV | Filtro de passagem curta de 500–600 nm |
†Filtros opcionais disponíveis com o respectivo fabricante
Estudo de caso 1: Forsyth Institute, Boston, MA, EUA.
 | Os dados a seguir foram fornecidos pelo escritório de EHS do Forsyth Institute. Eles calcularam os custos institucionais totais da utilização de corante de gel de DNA SYBR Safe versus brometo de etídio para coloração de géis de DNA. Levando em conta os custos de descarte do brometo de etídio, eles determinaram que o uso do corante de gel de DNA SYBR Safe resultou em uma economia de 14% para sua instituição. |
| SYBR Safe | Brometo de etídio | |
|---|---|---|
| Custos de reagentes | 400 µl do concentrado a US$ 40 por garrafa 5 µl do concentrado por gel US$ 0,50 por gel | 10 mL de do concentrado a 10 mg/mL a US$ 32 por frasco 5 µL do concentrado por gel US$ 0,016 por gel |
| Custos de descarte - materiais | US$ 0,00 | Filtro de carvão com capacidade de 20 L a US$ 33 por filtro 0,1 L por gel US$ 0,165 por gel |
| Custos de descarte – tempo e mão de obra | US$ 0,00 | 4 horas de trabalho a US$ 20 por hora para filtrar 20 L de resíduos 0,1 L de resíduos por gel US$ 0,40 por gel |
| Custos de descarte de despesas gerais | US$ 0,00 | Uso de água (sucção para filtragem) Taxas de resíduos perigosos (para descarte de filtros) Custos adicionais não calculados |
| Custo total por gel | US$ 0,50 | US$ 0,58++ |
Observação: esses dados foram derivados de uma instituição específica; os custos reais em outras instituições podem variar.
Benefícios da coloração de gel de DNA SYBR Safe
- 14% de redução de custos
- Economia de mão de obra de técnicos
- Ambiente de trabalho mais seguro
- Benefícios ambientais
- Sem resíduos perigosos
- Sem desperdício de água
Estudo de caso 2: Iowa State University, Ames, IA, EUA.
 | ISU descarta o corante de gel de DNA SYBR Safe no esgotoFuncionários de águas residuais em Ames, Iowa, Estados Unidos, aprovaram o descarte do corante de gel de DNA SYBR Safe como resíduo não tóxico, permitindo que a solução de corante diluída fosse despejada diretamente no esgoto na Iowa State University (ISU). |
| Avaliação da mutagenicidade e da segurança ambiental: Corante de gel de DNA SYBR Safe |
Ensaio para transformação morfológica em culturas primárias
Um laboratório independente investigou a capacidade de corante de gel de DNA SYBR Safe para induzir um aumento na transformação morfológica de células de embrião de hamster sírio (SHE), em relação às culturas de controle de veículos, após um período de exposição de 7 dias. Nenhum dos três grupos de tratamento (0,0500, 0,150 e 0,300 µg/mL) induziu um aumento significante na transformação morfológica em comparação com o controle veículo correspondente. Além disso, um aumento significativo da frequência de transformação morfológica também foi obtido a partir do tratamento de controle positivo com benzopireno a 5,0 mg/mL. O artigo de teste (corante de gel de DNA SYBR Safe) foi, portanto, avaliado como negativo no ensaio de triagem de transformação de células SHE sob condições de exposição de 7 dias deste estudo.
Conclusão: a corante de gel de DNA SYBR Safe não induz transformações em culturas primárias de células de embrião de hamster sírio (SHE) quando comparado com solvente sozinho, indicando fortemente que a corante de gel de DNA SYBR Safe é não carcinogênico. Por outro lado, o brometo de etídio testa positivo no ensaio de SHE, consistente com sua atividade conhecida como mutagênico forte.
Ensaios para aberrações cromossômicas e mutações para frente
Um laboratório independente investigou a capacidade do corante de gel de DNA SYBR Safe de induzir aberrações cromossômicas em linfócitos do sangue periférico cultivados com e sem ativação metabólica exógena. Nenhum aumento significativo no número de células com aberrações estruturais, poliploidia ou endorreduplicação foi observado no teste com ou sem ativação S9. Da mesma forma, não foram observados aumentos na frequência mutante que excederam os critérios mínimos nas células L5178Y TK+/- de linfoma de camundongo.
Conclusão: O corante de gel de DNA SYBR Safe não causa mutações nas células de linfoma de camundongo no locus TK, nem induz aberrações cromossômicas em linfócitos linfócitos de sangue periférico humano cultivados, com ou sem ativação metabólica S9, usando testes padronizados em comparação com controles apropriados.
Dados resumidos: análise de genotoxicidade de mamíferos de corante de gel de DNA SYBR Safe
| Teste in vitro* | Tipo de célula | Resultado com ativação S9† | Resultado sem ativação S9† |
|---|---|---|---|
| Transformação1 | Células embrionárias de hamster sírio (SHE) | NA | Negativo |
| Aberrações cromossômicas2 | Linfócitos de sangue periférico humano cultivados | Negativo | Negativo |
| Mutação para frente3,4 | Células de linfoma de camundongo L5178YTK+/- | Negativo | Negativo |
* Testes in vitro foram realizados pela Covance Laboratories Inc., Vienna, VA. † Fração de S9 de mamífero obtida de fígado de rato induzido por Aroclor 1254. NA = Não aplicável. 1Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 356, 1 (1996); 2Evans, H.J., in Chemical Mutagens, Principles and Methods for Their Detection, A. Hollaender, Ed., Vol. 4, (1976) pp. 129; 3Mutation Res 72, 447 (1980); 4Mutation Res 59, 61 (1979).
Ensaio para mutações reversas (teste de Ames)
As amostras foram pré-tratadas com fração S9 de mamífero e, em seguida, testadas. Nas cepas TA97a, TA98, TA100 e TA102 de S. typhimurium, um aumento das mutações reversas de mais de duas vezes em relação ao basal indica um resultado positivo para a mutagenicidade neste teste. Nas cepas TA1535, TA1537 e TA1538, um aumento de mais de três vezes nas mutações reversas em relação ao basal indica um resultado positivo.
Conclusão: em comparação com o brometo de etídio, a corante de gel de DNA SYBR Safe provoca menos mutações no teste padrão de Ames, conforme medido em várias cepas diferentes de Salmonella typhimurium. Resultados fracamente positivos para o corante de gel de DNA SYBR Safe neste teste ocorreram em quatro de sete cepas e somente com ativação por uma fração S9 de mamíferos (veja a figura).
Ensaio de toxicidade oral
Uma única administração oral de corante de gel de DNA SYBR Safe em 0,5X TBE a uma dose limite de 5.000 mg/kg em três ratas não produziu mortalidades ou sinais de toxicidade. O procedimento foi concebido para determinar a toxicidade oral aguda do material em teste. Um teste de triagem de limite foi realizado com três ratas Sprague Dawley, que receberam uma dose limite oral de 5.000 mg/kg de corante de gel de DNA SYBR Safe. Os animais foram observados quanto a mortalidade, mudança de peso e sinais de toxicidade por um período de duas semanas. Como as três ratas sobreviveram por duas semanas após a administração da dose, o LD50 para o artigo de teste foi considerado maior que a dose limite e não foi necessário nenhum teste adicional.
Conclusão: uma única administração oral de corante de gel de DNA SYBR Safe não produz sinais de mortalidade ou toxicidade na dose limite de 5.000 mg/kg.
Dados resumidos: toxicidade oral
| Análise | Método | Resultados |
|---|---|---|
| Toxicidade aquática* | Triagem aguda de varião de cabeça grande (Pimephales promelas) CA Title 22 | Não é perigoso ou tóxico para a vida aquática |
| Toxicidade oral** | Teste de toxicidade oral aguda de EPA OPPTS 870.1100 | LD50 > 5000 mg/kg |
* Realizado por AMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory, San Diego, CA.
** Realizado por Northview Pacific Laboratories, Inc., Hercules, CA.
| Resultados de impacto ambiental (EUA)Com base em testes abrangentes de segurança ambiental, o corante de gel de DNA SYBR Safe não é classificado como resíduo perigoso de acordo com as regulamentações federais dos EUA, como RCRA (Resource Conservation and Recovery Act, Lei de conservação e recuperação de recursos). O corante de gel de DNA SYBR Safe atende aos requisitos do Clean Water Act (Lei de águas limpas) e do NPDES (National Pollutant Discharge Elimination System, Sistema nacional de eliminação de descargas de poluentes). |
Conclusões
- O corante de gel de DNA SYBR Safe não é classificado como corrosivo, inflamável ou reativo de acordo com as diretrizes da EPA (Environmental Protection Agency, Agência de proteção ambiental) (Tabela 1).
- O corante de gel de DNA SYBR Safe não difere significativamente da solução tampão 0,5X TBE quando testado de acordo com as diretrizes do NPDES (National Pollutant Discharge Elimination System, Sistema nacional de eliminação de descargas de poluentes) (Tabela 2).
- O corante de gel de DNA SYBR Safe em 0,5X TBE é indistinguível de 0,5X TBE isoladamente em termos de teor de poluentes orgânicos. Ambas as amostras testaram negativas para a presença de uma extensa gama de compostos orgânicos (Tabela 3).
Tabela 1. Análise de resíduos perigosos do corante de gel de DNA SYBR Safe.
| Análise* | Método | Resultados |
|---|---|---|
| Corrosividade | EPA 150.1 | Não corrosivo (pH = 8,25) |
| Corrosividade (por Corrositex) | DOT-E 10904 | Categoria 2 não corrosivo |
| Capacidade de ignição | EPA 1010 | Não inflamável (<100 °C) |
| Reatividade | EPA 9010B/9030A | Nenhuma reatividade detectada |
* Todos os testes foram realizados por AMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory, San Diego, CA.
Tabela 2. Corante de gel de DNA SYBR Safe: visão geral da análise de NPDES*.
| Teste | Corante SYBR Safe em 0,5X TBE | 0,5X TBE |
|---|---|---|
| PH (150,1) | 8,45 | 8,48 |
| Cianeto total (335,2) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Demanda química de oxigênio (DQO; 410,1) | 7020 | 6840 |
| Amônia como nitrogênio (350,1) | 253 | 248 |
| Carbono orgânico total (415,1) | 2480 | 2360 |
| Fenólicos totais (420,1) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Pesticidas organoclorados e PCBs (608M) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Compostos orgânicos semivoláteis (625) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Compostos orgânicos voláteis (624) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
| Metais poluentes prioritários (Sb, As, Be, Cd, Cr, Cu, Pb, Hg, Ni, Se, Ag, Tl, Zn) (série EPA 200.7/200) | Nenhum detectado | Nenhum detectado |
* Todos os testes foram realizados por Columbia Analytical Services, Inc., Kelso, WA. Os métodos utilizados foram os descritos no CFR (Code of Federal Regulations, Código de Regulamentos Federais) Título 40, Parte 136.
Tabela 3. Corante de gel de DNA SYBR Safe: análise detalhada de compostos orgânicos*.
| Pesticidas organoclorados e PCBs (608M) | ||||
| alfa-BHC | beta-BHC | gama-BHC | delta-BHC (lindano) | Heptacloro |
| Aldrina | Heptacloro epóxido | Endosulfan | Dieldrina | 4,4'-DDE |
| Endrina | Endossulfno II | 4,4'-DDD | Aldeído endrina | Sulfato de endosulfan |
| 4,4'-DDT | Toxafeno | Clordano | Aroclor 1016 | Aroclor 1221 |
| Aroclor 1232 | Aroclor 1242 | Aroclor 1248 | Aroclor 1254 | Aroclor 1260 |
| Etilbenzeno | Bromofórmio | 1,1,2,2,-Tetracloro etano | 1,3-Dicloro benzeno | |
| Compostos orgânicos voláteis (624) | ||||
| Clorometano | Cloreto de vinil | Bromometano | Cloroetano | Triclorofluoro metano |
| 1,1-Dicloroeteno | Cloreto de metileno | trans-1,2-Dicloroeteno | 1,1-Dicloroetano | Clorofórmio |
| 1,1,1-Tricloroetano (TCA) | Tetracloreto de carbono | Benzeno | 1,2-Dicloroetano (EDC) | Tricloroeteno (TCE) |
| 1,2-Dicloropropano | Bromodicloro metano | 2-Éter cloroetilo vinílico | trans-1,3-Dicloro- propeno | Tolueno |
| cis-1,3-Dicloro propeno | 1,1,2-Tricloroetano | Tetracloroeteno (PCE) | Dibromocloro metano | Clorobenzeno |
| 1,4-Diclorobenzeno | 1,2-Diclorobenzeno | Acroleína | Acrilonitrila | |
| Compostos orgânicos semivoláteis (625) | ||||
| N-Nitrosodimetil- amina | Éter dicloroetílico ou Bis (2-cloroetil) éter | Fenol | 2-Clorofenol | Éter di-isopropílico |
| Hexacloroetano | N-Nitrosodi-n-propil- amina | Nitrobenzeno | Isoforona | 2-Nitrofenol |
| 2,4-Dimetilfenol | 4-Nitrofenol | 2,4-Diclorofenol | 1,2,4-Triclorobenzeno | Naftaleno |
| Hexaclorobutadieno | 4-Cloro-3-metilfenol | Hexaclorociclo- pentadieno | 2,4,6-Triclorofenol | 2-Cloronap 2-Cloronaftaleno |
| Acenaftileno | Dimetil ftalato | 2,6-Dinitrotolueno | Acenafteno | 2,4-Dinitrofenol |
| Bis (2-cloroetóxi) metano | 2,4-Dinitrotolueno | Fluoreno | Dietil ftalato | 2-Metil-4,6-dinitrofenol |
| N-Nitrosodifenil amina | 4-Bromofenil fenil éter | Hexaclorobenzeno | Pentaclorofenol | Fenantreno |
| Antraceno | Di-n-butil ftalato | Fluoranteno | Benzidina | Pireno |
| Butil benzil ftalato | 3,3'-Diclorobenzidina | Benzo (a)antraceno | Criseno | Bis(2-etilhexil) ftalato |
| Di-n-octil ftalato | Benzo(b)fluoranteno | Benzo(k)fluoranteno | Benzo(a)pireno | Indeno(1,2,3-cd)pireno |
| Dibenzo(a,h)antraceno | Benzo(g,h,i)perileno | 1,2-Difenilidrazina | 2,3,7,8-Tetracloro- dibenzo-p-dioxina | 4-Clorofenil fenil éter |
As amostras analisadas foram 0,5X TBE e 0,5X TBE + 1X corante de gel de DNA SYBR Safe; nenhum dos compostos listados na tabela foi detectado em qualquer amostra. Os testes foram realizados por Columbia Analytical Services, Inc., Kelso, WA. Os métodos utilizados foram os descritos no CFR (Code of Federal Regulations, Código de Regulamentos Federais) Título 40, Parte 136.
Ligado a ácidos nucleicos, o corante SYBR Safe tem o máximo de excitação de fluorescência a 280 e 502 nm e o máximo de emissão a 530 nm. O DNA corado pode ser visualizado e analisado utilizando sistemas de geração de imagens equipados com uma fonte de excitação na faixa UV ou entre 470 nm e 530 nm.
Recomendações de filtro para uso com corante de gel de DNA SYBR Safe
A tabela abaixo lista os filtros recomendados para sistemas específicos de documentação de gel. Se o seu sistema não estiver listado, entre em contato com o fabricante para obter recomendações. Observe que os espectros de excitação e emissão do corante de gel de DNA SYBR Safe são muito semelhantes aos dos corantes SYBR Green I, SYBR Green II e SYBR Gold, bem como da fluoresceína (FITC). Portanto, filtros apropriados para esses corantes também podem ser usados. Não é necessário um filtro de câmera com o transiluminador de luz azul do Safe Imager; o filtro âmbar fornecido com o instrumento serve para esse fim.
| Instrumento | Fabricante | Fonte de excitação | Filtro de emissão |
|---|---|---|---|
| Câmera Polaroid® | Polaroid® | UV | Filtro fotográfico Invitrogen™ SYBR™ Safe (Cat. N° S37100) |
| FCR-10 | Polaroid® | UV | #3-4218 |
| AlphaImager | Alpha Innotech | 302 nm | SYB-500 |
| AlphaDigiDoc RT | Alpha Innotech | Transiluminador UV | |
| Cobertura, suporte da câmera | Alpha Innotech | Transiluminador UV | |
| Gabinete de luz DE500 ou DE400 com 2,17" de diâmetro. | Alpha Innotech | Transiluminador UV | SYB-100 |
| Gabinete de luz DE500 ou DE400 com 2" de diâmetro. | Alpha Innotech | Transiluminador UV | SYB-500 |
| VersaDoc Imaging Systems | Bio-Rad | Broadband UV | 520LP |
| Molecular Imager FX Systems | Bio-Rad | 488 nm | 530 DF 30 |
| Sistemas Gel Doc | Bio-Rad | 302 nm | 520DF30 (#170-8074)† |
| Typhoon 9400/9410 | GE Healthcare | 488 nm | 520 BP 40 |
| Typhoon 9200/9210/8600/8610 | GE Healthcare | 488 nm | 526 SP |
| FluorImager | GE Healthcare | 488 nm | 530 DF 30 |
| Storm | GE Healthcare | Azul (modo de fluorescência) | |
| ImageMaster VDS-CL | GE Healthcare | Transmissão | UV baixo |
| UltraCam/gerador de imagens de gel | Ultra-Lum | UV | Filtro amarelo (#990-0804-07)† |
| Omega Systems | Ultra-Lum | UV | 520 nm |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#60-2034)† |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#62-4289)† |
| FOTO/Analyst Minivisionary | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#62-2535)† |
| FOTO/Analyst Apprentice | Fotodyne | UV | Verde fluorescente (#60-2056)† |
| FUJI FLA-3000 | FUJI Film | 473 nm | 520LP |
| BioDocIt/AC1/EC3/BioSpectrum | UVP | 302 nm | SYBR Green (#38-0219-01)† ou SYBR Gold (#38-0221-01)† |
| Gel Logic | Kodak | UV 535 | 535 nm WB50 |
| Mini BIS/Mini BIS Pro | DNR Bioimaging | UV 320 | Amarelo |
| Compact BIS | DNR Bioimaging | UV 320 | Laranja |
| Syngene Instruments | Syngene | UV | Filtro de passagem curta de 500–600 nm |
†Filtros opcionais disponíveis com o respectivo fabricante
Estudo de caso 1: Forsyth Institute, Boston, MA, EUA.
| Os dados a seguir foram fornecidos pelo escritório de EHS do Forsyth Institute. Eles calcularam os custos institucionais totais da utilização de corante de gel de DNA SYBR Safe versus brometo de etídio para coloração de géis de DNA. Levando em conta os custos de descarte do brometo de etídio, eles determinaram que o uso do corante de gel de DNA SYBR Safe resultou em uma economia de 14% para sua instituição. |
| SYBR Safe | Brometo de etídio | |
|---|---|---|
| Custos de reagentes | 400 µl do concentrado a US$ 40 por garrafa 5 µl do concentrado por gel US$ 0,50 por gel | 10 mL de do concentrado a 10 mg/mL a US$ 32 por frasco 5 µL do concentrado por gel US$ 0,016 por gel |
| Custos de descarte - materiais | US$ 0,00 | Filtro de carvão com capacidade de 20 L a US$ 33 por filtro 0,1 L por gel US$ 0,165 por gel |
| Custos de descarte – tempo e mão de obra | US$ 0,00 | 4 horas de trabalho a US$ 20 por hora para filtrar 20 L de resíduos 0,1 L de resíduos por gel US$ 0,40 por gel |
| Custos de descarte de despesas gerais | US$ 0,00 | Uso de água (sucção para filtragem) Taxas de resíduos perigosos (para descarte de filtros) Custos adicionais não calculados |
| Custo total por gel | US$ 0,50 | US$ 0,58++ |
Observação: esses dados foram derivados de uma instituição específica; os custos reais em outras instituições podem variar.
Benefícios da coloração de gel de DNA SYBR Safe
- 14% de redução de custos
- Economia de mão de obra de técnicos
- Ambiente de trabalho mais seguro
- Benefícios ambientais
- Sem resíduos perigosos
- Sem desperdício de água
Estudo de caso 2: Iowa State University, Ames, IA, EUA.
| ISU descarta o corante de gel de DNA SYBR Safe no esgotoFuncionários de águas residuais em Ames, Iowa, Estados Unidos, aprovaram o descarte do corante de gel de DNA SYBR Safe como resíduo não tóxico, permitindo que a solução de corante diluída fosse despejada diretamente no esgoto na Iowa State University (ISU). |
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