PCR em tempo real: Noções básicas sobre C_t

O PCR em tempo real, também chamado de PCR quantitativo ou qPCR, pode fornecer um método simples e elegante para determinar a quantidade de uma sequência do alvo ou gene presente em uma amostra. Sua simplicidade pode, às vezes, levar a problemas, negligenciando alguns dos fatores críticos que fazem com que ele funcione. Esta revisão destacará esses fatores que devem ser considerados ao configurar e avaliar uma reação de PCR em tempo real.

Fatores que podem influenciar C_t

C_t Ct (cycle threshold) é a intersecção entre uma curva de amplificação e a linha do threshold (Figura 1B). É uma medida relativa da concentração do alvo na reação de PCR. Muitos fatores afetam o valor absoluto de C_t, além da concentração do alvo. Discutiremos os fatores independentes de modelo mais comuns que podem influenciar C_t e descreveremos como avaliar o desempenho de uma reação de PCR em tempo real.

A Figura 1, acima, mostra vários parâmetros da plotagem de amplificação da reação em tempo real. A fase exponencial na Figura 1B corresponde à fase linear na Figura 1C. O limite deve ser definido na fase linear da amplificação na Figura 1C. O valor de C _t aumenta com uma quantidade decrescente de template. No entanto, os artefatos do mix de reação ou do instrumento que alteram as medições de fluorescência associadas ao cálculo de C _t resultarão em alterações independentes do template no valor de C_t . Portanto , os valores de C _t das reações de PCR executados em condições diferentes ou com reagentes diferentes não podem ser comparados diretamente.

A emissão de fluorescência de qualquer molécula depende de fatores ambientais, como o pH e a concentração de sal de uma solução. a Figura 2 mostra os dados brutos de fluorescência de uma sonda TaqMan Applied Biosystems com background de dois master mix diferentes. Observe que a intensidade da fluorescência é maior no master mix A, mesmo que o alvo, sonda e ROX tenham a mesmas concentrações nos dois casos.

O valor de ΔRn resultante variará, portanto, conforme mostrado na Figura 3. Observe que os sinais de fluorescência da baseline, em um fator independente de template, são diferentes para os dois master mix(Figura 3A). As variações no valor de C_t não refletem o desempenho geral do sistema de reação (Figura 3B). Os master mix com sensibilidade equivalente podem ter valores de C _t absolutos diferentes.

O valor da Rn é calculado como a relação da fluorescência do dye FAM FAM™ Applied Biosystems™ dividida pela fluoresncência de ROX. Portanto, uma quantidade menor de fluorescência ROX produziria um valor mais alto de Rn, supondo que o sinal de fluorescência de FAM não seja alterado. Isso levaria a um aumento na Rn de baseline e, posteriormente, a uma ΔRn menor, bem como a um valor C_t diferente. O novo valor de C _t obtido ao diminuir o nível de ROX não tem nenhuma influência na verdadeira sensibilidade da reação, mas pode ter outras consequências não intencionais. Baixas concentrações de ROX podem resultar em um desvio padrão maior do valor de C_t, conforme mostrado na Figura 4. Quanto maior o desvio padrão, menor a confiança para distinguir entre pequenas diferenças na concentração do alvo (consulte a seção de precisão abaixo).

A eficiência de uma reação de PCR também pode afetar C_t. Uma série de diluição amplificada sob condições de baixa eficiência pode produzir uma curva padrão com uma inclinação diferente de uma amplificação sob condições de alta eficiência. Na Figura 5, duas amostras (X e Y) amplificadas em condições de baixa e de alta eficiência mostram valores de C _t diferentes para a mesma concentração do alvo. Nesse exemplo, embora a condição de alta eficiência (a curva azul na Figura 5) forneça um C_t posterior em altas concentrações, ela resulta em melhor sensibilidade em baixas concentrações do alvo. A eficiência do PCR depende do ensaio, do desempenho do master mix e da qualidade da amostra. Em geral, uma eficiência entre 90% e 110% é considerada aceitável, e a outra, pode ser valiosa para se concluir que há menos templates na primeira amostra, supondo-se que todos os outros fatores, como instrumentos, reagentes e ensaios, sejam iguais. No entanto, isso não é verdade se diferentes instrumentos, reagentes, primers e sondas ou volumes de reação estiverem envolvidos na produção dos dois C_ts. Portanto, a comparação do valor de C _t absoluto só é significativa ao comparar experimentos usando as mesmas condições de reação, conforme definido acima.

Para comparar duas reações em que uma condição é alterada (por exemplo, dois master mix diferentes ou dois instrumentos diferentes), os seguintes parâmetros devem ser avaliados.

Faixa dinâmica

Para avaliar adequadamente a eficiência do PCR, são necessários, no mínimo, 3 réplicas e 5 logs de contentração de template. A razão para esse nível sugerido de rigor é ilustrada na Figura 6, que demonstra a possível variação matemática da inclinação ou a eficiência obtida ao testar diluições acima de 1 1 log vs 5 logs. Assim, mesmo que o ensaio seja 100% eficiente, pode-se obter uma faixa de 70% a 170% ao testar uma série de diluição de um único log, devido ao desvio padrão em uma única diluição. Para o mesmo número de diluições ou réplicas em uma gama de 5 logs, o artefacto potencial é apenas ±8 %. Isso significa que, para uma eficiência de 94% em uma gama de 5 logs, o ensaio teria uma faixa de 88% a 100% de eficiência. Para determinar com precisão a eficiência de uma reação de PCR, uma série de diluição de 5 logs deve ser executada. Uma inclinação de –3,3 ±10% reflete uma eficiência de 100% ±10%. Uma reação de PCR com eficiência mais baixa terá sensibilidade mais baixa.

Valor de R²

Outro parâmetro crítico para avaliar a eficiência do PCR é R², que é um termo estatístico que indica a qualidade de um valor na previsão de outro. Quando R² é 1, o valor de Y (Ct) pode ser usado para prever com precisão o valor de   (Figura 7a). Se R² for 0, o valor de X não pode ser previsto a partir do valor de Y (Figura 7B). Um valor de R ² > de 0,99 proporciona uma boa confiança na correlação de dois valores.

Precisão

O desvio padrão (raiz quadrada da variância) é a medida de precisão mais comum. Se muitos pontos de dados estiverem próximos da média, o desvio padrão será pequeno. Se muitos pontos de dados estiverem longe da média, o desvio padrão será grande.

Na prática, um conjunto de dados com um número suficiente de réplicas forma uma distribuição aproximadamente normal. Isso é frequentemente justificado pelo teorema do limite central clássico, que afirma que somas de muitas variáveis aleatórias independentes e distribuídas de forma idêntica tendem a ser distribuídas normalmente como um limite. Conforme mostrado na Figura 8A, aproximadamente 68% dos valores estão dentro de 1 desvio padrão da média, 95% estão dentro de dois desvios padrão e 99,7% estão dentro de 3 desvios padrão.

Se um PCR for 100% eficiente, a diferença de C _t entre duas concentrações sucessivas em uma diluição de 2 vezes é de 1 (Figura 8B). Para poder quantificar uma diluição de 2 vezes em mais de 99,7% dos casos, o desvio padrão precisa ser de ≤ 0,167. Quanto maior o desvio padrão, menor a capacidade de distinguir entre diluições de 2 vezes. Para poder discriminar entre uma diluição de 2 vezes em mais de 95% dos casos, o desvio padrão deve ser de ≤ 0,250 (Figura 8C).

Sensibilidade

Qualquer sistema capaz de ampliar e de detectar efetivamente uma cópia do modelo inicial atingiu o nível máximo de sensibilidade, independentemente do valor absoluto da C_t.

Como descrito anteriormente, a eficiência é um fator-chave para determinar a sensibilidade de uma reação (Figura 5). Outra consideração importante ao se detectar números de cópias muito baixos é que a distribuição normal do modelo não é esperada. Em vez disso, uma distribuição de Poisson é seguida, o que prevê que, em um grande número de réplicas contendo uma média de uma cópia do modelo inicial, aproximadamente 37%, não deve realmente ter cópias, apenas 37% deve conter uma cópia e 18% deve conter duas cópias (consulte a Figura 9). Assim, para uma detecção confiável de número baixo de cópias, um grande número de réplicas é necessário para fornecer significância estatística e superar a limitação da distribuição de Poisson.

Eficiência, R², precisão e sensibilidade são usadas para determinar o desempenho de uma reação de PCR ao comparar diferentes condições de reação. Para uma avaliação rigorosa, todos os fatores listados na Tabela 1 devem ser avaliados juntos. Além desses fatores, os controles experimentais adequados (como, por exemplo, sem controle de modelo, sem controle de RT) e a qualidade do modelo devem ser avaliados e validados.