Visão geral de Western Blot

O termo "blotting" refere-se à transferência de amostras biológicas de um gel para uma membrana e sua subsequente detecção na superfície da membrana. Um experimento de Western Blot, ou Western Blotting (também chamado de imunoblotting, porque um anticorpo é usado especificamente para detectar seu antígeno) foi introduzido por Towbin, et al. em 1979 e é agora uma técnica de rotina para análise de proteínas. A especificidade da interação anticorpo-antígeno permite que uma proteína alvo seja identificada no meio de uma mistura complexa de proteínas. O Western Blotting pode produzir dados qualitativos e semiquantitativos sobre a proteína de interesse.

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O primeiro passo em um procedimento de Western Blotting é separar as macromoléculas em uma amostra usando eletroforese em gel. Posteriormente, as moléculas separadas são transferidas ou absorvidas em uma segunda matriz, geralmente uma membrana de nitrocelulose ou difluoreto de polivinilideno (PVDF). Em seguida, a membrana é bloqueada para evitar qualquer ligação não específica de anticorpos à superfície da membrana. Mais comumente, a proteína transferida é então sondada com uma combinação de anticorpos: um anticorpo específico para a proteína de interesse (anticorpo primário) e outro anticorpo específico para a espécie hospedeira do anticorpo primário (anticorpo secundário). Muitas vezes, o anticorpo secundário é complexado com uma enzima que, quando combinada com um substrato adequado, produzirá um sinal detectável. Substratos cromogênicos produzem um precipitado na membrana, resultando em alterações colorimétricas visíveis ao olho. Os métodos de detecção mais sensíveis utilizam um substrato quimioluminescente que produz luz como subproduto da reação com a enzima conjugada com o anticorpo. A saída de luz pode ser capturada usando filme. No entanto, os instrumentos de imagem digital baseados em câmeras CCD (Charge-coupled Device, dispositivo acoplado de carga) estão se tornando alternativas populares ao filme para capturar o sinal de quimiluminescência. Como alternativa, anticorpos com marcas fluorescentes podem ser usados, o que requer detecção usando um instrumento capaz de capturar o sinal fluorescente. O Blotting fluorescente é uma técnica mais nova, e sua popularidade está crescendo porque fornece o potencial de multiplexar (detectar proteínas múltiplas em um único blot). Seja qual for o sistema utilizado, a intensidade do sinal deve estar correlacionada com a abundância do antígeno na membrana.

Os procedimentos variam muito para a etapa de detecção de um experimento de Western Blot. Uma variação comum envolve detecção direta versus indireta. Com o método de detecção direta, é utilizado um anticorpo primário conjugado com enzima ou fluoróforo para detectar o antígeno de interesse no blot. Esse método de detecção não é amplamente utilizado, pois a maioria dos pesquisadores prefere o método de detecção indireta por uma variedade de razões. No método de detecção indireta, um anticorpo primário não rotulado é usado primeiro para ligar ao antígeno. Subsequentemente, o anticorpo primário é detectado utilizando um anticorpo secundário conjugado com enzima ou fluoróforo. Os rótulos (ou moléculas conjugadas) podem incluir biotina, sondas fluorescentes, como fluoróforos Invitrogen Alexa Flour ou DyLight, e conjugados enzimáticos, como peroxidase de rábano silvestre (HRP) ou fosfatase alcalina (AP). O método indireto oferece muitas vantagens em relação ao método direto, descritos abaixo.

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A eletroforese em gel é uma técnica na qual moléculas carregadas, como proteínas ou DNA, são separadas de acordo com as propriedades físicas, pois são forçadas através de um gel por uma corrente elétrica. As proteínas são comumente separadas usando eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para caracterizar proteínas individuais em uma amostra complexa ou para examinar várias proteínas em uma única amostra. Quando combinada com o Western Blotting, a PAGE é uma poderosa ferramenta analítica que fornece informações sobre massa, carga, pureza ou presença de uma proteína. Existem várias formas de PAGE e podem oferecer diferentes tipos de informação sobre as proteínas de interesse. Por exemplo, a PAGE não desnaturada, ou PAGE nativa, separa as proteínas de acordo com suas taxas de carga de massa. Em contraste, o sulfato dodecil de sódio-PAGE, ou SDS-PAGE, separa as proteínas de acordo com a massa devido à carga negativa transmitida nas proteínas ligadas ao detergente de SDS iônico.

Vários sistemas de buffer ou químicas de gel estão disponíveis para eletroforese em gel de proteína. Cada sistema oferece vantagens exclusivas ao resolver proteínas de diferentes pesos moleculares.

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Após a eletroforese, a proteína deve ser transferida do gel para uma membrana. Há uma variedade de métodos que foram usados para esse processo que incluem, mas não se limitam a, transferência por difusão, transferência capilar, transferência por blotting a vácuo e eletroeluição. O método de transferência mais comumente usado para proteínas é a eletroeluição ou a transferência eletroforética devido à sua velocidade e eficiência de transferência. Este método usa a mobilidade eletroforética das proteínas para transferi-las do gel para a membrana. A transferência eletroforética de proteínas envolve a colocação de um gel de poliacrilamida contendo proteínas em contato direto com um pedaço de nitrocelulose ou outro suporte adequado para ligação de proteínas e a "colocação" entre dois eletrodos submersos em uma solução condutora. O processo envolve o uso de almofadas porosas e papel de filtro para facilitar a transferência. Quando um campo elétrico é aplicado, as proteínas se movem para fora do gel de poliacrilamida e para a superfície da membrana, onde as proteínas ficam firmemente presas. O resultado é uma membrana com uma cópia do padrão proteico que estava originalmente no gel de poliacrilamida.

A eficiência da transferência pode variar drasticamente entre as proteínas, com base na capacidade de uma proteína migrar para fora do gel e na sua propensão de se ligar à membrana em um determinado conjunto de condições. A eficiência da transferência depende de fatores como a composição do gel, o contato completo do gel com a membrana, a posição dos eletrodos, o tempo de transferência, o tamanho e a composição das proteínas, a força de campo e a presença de detergentes e álcool no tampão.

Após a transferência e antes de prosseguir com o Western Blot, a proteína total na membrana pode ser avaliada com uma coloração de proteína para verificar a eficiência da transferência. O gel também pode ser corado para confirmar que a proteína foi retirada do gel, mas isso não garante a ligação eficiente da proteína à membrana. Como os corantes podem interferir na ligação e na detecção de anticorpos, é ideal uma coloração proteica facilmente removível. A coloração de Ponceau S é o reagente mais utilizado para a coloração irreversível de proteínas em uma membrana, embora tenha uma sensibilidade limitada, não é bom para fotografar e possa desaparecer rapidamente, dificultando a documentação. Alternativas superiores para a coloração de proteínas em nitrocelulose ou membranas PVDF estão disponíveis, que permitem a detecção de níveis de nanogramas de proteínas, são facilmente fotografadas e não desaparecem até serem removidas.

Comparação da coloração de proteína reversível com a coloração de Ponceau S. O Peso Molecular (PM) pré-corado foi aplicado a cada gel (faixa 1), e os marcadores de MW de proteína não corada foram diluídos serialmente e processados em cada gel de poliacrilamida Tris-glicina-SDS de 4-20% (faixas 2-10). A eletroeluição foi usada para transferir proteínas para membranas PVDF. O corante reversível Thermo Scientific Pierce foi aplicado por 1 minuto de acordo com o protocolo (Painel A). O blot corou com 0,1% de Ponceau S em ácido acético a 5% por 5 minutos, de acordo com o protocolo (Painel B).

Existem várias estratégias de eletrotransferência. Os métodos mais comuns são: úmido, semisseco e seco, cada um deles requer considerações especiais em relação a tempo, custo e reagentes e aparelhos necessários. A transferência úmida (também chamada de transferência em tanque) oferece alta eficiência de transferência, flexibilidade no sistema de tampão e opções de método, mas a um custo de tempo e esforço. A transferência semisseca proporciona conveniência e economia de tempo com a flexibilidade de usar vários tipos de sistemas de tampão. No entanto, uma transferência semisseca pode ter uma eficiência mais baixa de transferência de proteínas de grande peso molecular (>300 kDa). A transferência a seco oferece transferências de alta qualidade com velocidade e conveniência, pois os tampões não são necessários, mas têm flexibilidade limitada nos consumíveis.

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Explore: Sistemas de transferência

Os suportes de membrana usados na análise de Western Blotting têm uma alta afinidade para proteínas. Portanto, após a transferência das proteínas do gel, é importante bloquear a superfície restante da membrana para evitar a ligação não específica dos anticorpos de detecção durante as etapas subsequentes. Uma variedade de tampões de bloqueio que variam de leite ou soro normal a proteínas altamente purificadas foi usada para bloquear locais livres em uma membrana. O tampão de bloqueio deve melhorar a sensibilidade do ensaio, reduzindo a interferência de fundo e melhorando a relação sinal-ruído. Não existe um único bloqueador que funcione em cada experimento, pois cada complexo anticorpo-antígeno tem características únicas. Testes empíricos de tampões de bloqueio são essenciais para otimizar um experimento de Western Blot. Os tampões de bloqueio são frequentemente feitos por investigadores no laboratório; no entanto, os tampões de bloqueio disponíveis no mercado oferecem conveniência.

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Como outros procedimentos de imunoensaio, a análise de análises Western Blotting consiste em uma série de incubações com diferentes reagentes imunoquímicos separados por etapas de lavagem. Etapas de lavagem são necessárias para remover reagentes não ligados e reduzir o sinal de fundo, aumentando assim a relação sinal/ruído. A lavagem insuficiente pode resultar em um sinal de fundo alto, enquanto a lavagem excessiva pode resultar em diminuição da sensibilidade causada pela eluição do anticorpo e/ou antígeno do blot. Assim como em outras etapas no blot de Western Blot, uma variedade de tampões pode ser usada.

A solução salina com tampão com Tris (TBS) e a solução salina com tampão com fosfato (PBS) são os tampões de lavagem mais utilizados. Na maioria dos casos, as soluções PBS e TBS podem ser intercambiáveis. No entando, há situações onde cada um deve ser usado. Por exemplo, o TBS deve ser usado ao se usar sistemas com anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina (AP) ou ao detectar proteínas fosforiladas com anticorpos específicos para fosfatos.

Ocasionalmente, as formulações de tampão de lavagem consistem em um detergente como Tween 20 a 0,05% para auxiliar na remoção de material não especificamente ligado. Dependendo das especificidades do ensaio, a quantidade de detergente no tampão de lavagem irá variar, embora as concentrações típicas sejam de 0,05 a 0,5% para detergentes como Tween 20. Outra técnica comum é adicionar uma diluição de 1:10 da solução de bloqueio ao tampão de lavagem. A inclusão do agente de bloqueio com o detergente pode ajudar o sinal de fundo o fundo do ensaio, impedindo a eluição da proteína de bloqueio da membrana e/ou permitindo que ocorram interações não específicas com a proteína em solução em vez das imobilizadas na membrana.

É importante observar que os detergentes, assim como as soluções proteicas, podem promover o crescimento microbiano. Embora seja conveniente fazer estoques pré-diluídos de detergentes como NP-40, CHAPS e Tween 20, os fungos podem crescer nessas soluções, o que pode levar a um alto ruído de fundo. Além disso, os detergentes podem conter quantidades significativas de peróxidos que causarão sinal de fundo ao se usar substratos de peroxidase de rábano. Portanto, é importante usar detergentes de alta pureza.

A análise de Western Blotting é normalmente realizada através da sondagem da membrana bloqueada com um anticorpo primário que reconhece uma proteína ou epítopo específico em um grupo de proteínas (por exemplo, domínio SH2 ou tirosina fosforilada). A escolha de um anticorpo primário para um Western Blot dependerá do antígeno a ser detectado e quais anticorpos estão disponíveis para esse antígeno. Também é importante observar que nem todos os anticorpos primários são adequados para Western Blot e que a aplicação deve ser verificada, se possível, antes da compra de um novo anticorpo primário.

Em geral, o anticorpo primário que reconhece a proteína alvo em um Western Blot não é diretamente detectável. Portanto, os anticorpos secundários marcados são usados como o meio de, em última análise, detectar o antígeno alvo (detecção indireta). Uma ampla variedade de anticorpos secundários rotulados pode ser usada para detecção de Western Blot. A escolha do anticorpo secundário depende da espécie de animal em que o anticorpo primário foi produzido (a espécie hospedeira) ou de qualquer tag ligada ao anticorpo primário (por exemplo, biotina, histidina (His), hemaglutinina (HA) etc.). Por exemplo, se o anticorpo primário for um anticorpo monoclonal de camundongo não modificado, o anticorpo secundário deverá ser um anticorpo secundário IgG anticamundongo (ou não IgG) obtido de um hospedeiro que não seja camundongo.

Anticorpos para Western Blotting são normalmente usados como soluções diluídas, e os fabricantes podem recomendar o uso de faixas de uma diluição de 1/100–1/500.000 de uma solução estoque de 1 mg/mL. No entanto, a diluição ideal de um determinado anticorpo com um determinado sistema de detecção deve ser determinada experimentalmente. Sistemas de detecção mais sensíveis requerem menos anticorpos do que sistemas de sensibilidade mais baixos e podem resultar em reduções substanciais nos custos de anticorpos e permitir que um fornecimento limitado de anticorpos seja estendido em mais experimentos. A utilização de quantidades mais baixas de anticorpos também pode ter o benefício adicional de um fundo reduzido, pois a quantidade limitada de anticorpos mostra maior especificidade para o alvo com maior afinidade.

As diluições de anticorpos são normalmente feitas no tampão de lavagem. A presença de detergente e uma pequena quantidade do agente bloqueador no diluente de anticorpo ajuda frequentemente a minimizar o fundo, aumentando assim a relação sinal-ruído. Por outro lado, a adição de agente de bloqueio ou detergente em excesso à solução de diluição de anticorpos pode impedir a ligação eficiente do anticorpo ao antígeno, causando um sinal reduzido, bem como um fundo reduzido.

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Explore: Anticorpos Western Blot

Embora existam muitas marcas diferentes que podem ser conjugadas a um anticorpo secundário ou primário, o método de detecção utilizado limita a escolha do que pode ser utilizado em um ensaio de Western Blotting. Os radioisótopos foram amplamente utilizados no passado, mas são caros, têm uma vida útil curta, não oferecem melhoria na relação sinal-ruído e requerem manuseio e descarte especiais. Conjugados alternativos são enzimas e fluoróforos.

Os conjugados enzimáticos são mais comumente usados para Western Blotting e, embora exijam etapas extras, podem ser extremamente sensíveis quando otimizados com um substrato apropriado. A peroxidase de rábano (HRP) e, em menor medida, a fosfatase alcalina (AP) são as duas enzimas mais utilizadas como rótulos para a detecção de proteínas. Uma matriz de substratos cromogênicos, fluorogênicos e quimioluminescentes está disponível para uso com qualquer uma das enzimas. A fosfatase alcalina oferece uma vantagem distinta em relação a outras enzimas, pois sua taxa de reação permanece linear, melhorando a sensibilidade ao permitir que uma reação prossiga por um período mais longo. Infelizmente, o maior tempo de reação geralmente leva a um sinal de fundo alto, resultando em baixas taxas de sinal/ruído. Os anticorpos conjugados com peroxidase de rábano são considerados superiores aos conjugados por anticorpo-AP em relação às atividades específicas da enzima e do anticorpo devido ao tamanho menor da enzima HRP e à compatibilidade com reações conjugadas. Além disso, a alta taxa de atividade, a boa estabilidade, o baixo custo e a ampla disponibilidade de substratos fazem da HRP a enzima escolhida para a maioria das aplicações.

Os anticorpos conjugados com enzimas oferecem a maior flexibilidade na detecção e nos métodos de documentação para Western Blotting devido à variedade de substratos disponíveis. O sistema de detecção/documentação mais simples é utilizar substratos cromogênicos. Embora não sejam tão sensíveis quanto outros substratos, os substratos cromogênicos permitem a visualização direta do desenvolvimento do sinal. Infelizmente, os substratos cromogênicos tendem a desaparecer à medida que o blot seca ou durante o armazenamento, tornando o próprio blot um meio de documentação não confiável. No entanto, é bastante simples fotocopiar ou escanear diretamente o blot para fazer uma réplica permanente dos resultados cromogênicos do Western Blot.

Os substratos de blotting quimioluminescente diferem de outros substratos, pois o sinal é um produto transitório da reação enzima-substrato e persiste somente enquanto a reação estiver ocorrendo. Se o substrato for usado ou a enzima perder atividade, a reação será interrompida, e o sinal será perdido. No entanto, em ensaios bem otimizados usando diluições adequadas de anticorpos e substrato suficiente, a reação pode produzir sinal de luz estável por 1 a 24 horas, dependendo do substrato, permitindo uma detecção consistente e sensível que pode ser documentada com filme de raios X ou equipamento de geração de imagem digital. Embora o filme de raios X possa ser usado para obter dados semiquantitativos, a geração de imagem digital é mais sensível devido à ampla faixa dinâmica de detecção, permitindo que os pesquisadores obtenham dados quantitativos de Western Blots.

O uso de anticorpos conjugados com fluoróforo requer menos etapas, pois não há etapa de desenvolvimento de substrato no ensaio. Embora o protocolo seja mais curto, este método requer equipamento especial para detectar e documentar o sinal fluorescente devido à necessidade de uma fonte de luz de excitação. Avanços recentes na geração de imagem digital e no desenvolvimento de fluoróforos de última geração, como infravermelho, infravermelho próximo e pontos quânticos, aumentaram a sensibilidade e a popularidade do uso de sondas fluorescentes para análises de Western Blotting e outros imunoensaios. Embora o equipamento e os anticorpos conjugados com fluoróforos possam ser bastante caros, esse método tem a vantagem adicional da compatibilidade multiplex (usando mais de um fluoróforo no mesmo experimento). Além disso, os resíduos químicos são ainda mais reduzidos em comparação com outros procedimentos de blotting.

Continuar leitura: Western Blotting quimioluminescente
Explore: Reagentes de detecção
Explore: Sistemas de imagens de Western Blot

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• Manual: Manual técnico de eletroforese em gel de proteína
• Manual: Manual técnico de Western Blotting
• Manual: Pesquisa de proteínas
• Manual: Ferramentas baseadas em anticorpos para pesquisa biomédica
• Dica técnica Nº 24: Otimizar as concentrações de antígeno e anticorpo para Western Blots
• Dica técnica Nº 59: Escolher um anticorpo secundário: um guia para a especificidade do fragmento
• Dica técnica Nº 32: Guia para substratos enzimáticos para Western Blotting