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mRNA疫苗研究
mRNA疫苗
mRNA疫苗打破了传统灭活、减毒疫苗的免疫激活模式，创新性地利用人体本身细胞生产抗原，以此激活特异性免疫。mRNA疫苗的保护率极高，能达到90%。在研发上，mRNA疫苗能够快速地更新迭代以应对不断出现的变异毒株，且生产过程短，只需要60-70天。对于新型冠状病毒疫苗的研制，除了抗原设计外，选择合适的载体也是至关重要的。在疫情影响下，mRNA 疫苗让科研人员愈发重视，关于它的各项研究正在如火如荼地进行中。
争分夺秒|赛默飞全流程助力mRNA COVID-19疫苗研发
核酸疫苗-mRNA关键质量属性CQA
通过工艺开发和质量控制对产品进行描述：为了使疫苗能被监管机构接受，需要对纯度/杂质监测(CQAs)进行深入的分析表征和确定的标准，以确保安全性和有效性。这意味着杂质需要通过表征来理解，定义可接受的水平，然后监测安全性和有效性。
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行业领先的mRNA解决方案-加速赋能实现企业关键性进展
课程一：理想中的二维液相色谱系统——疫苗研究的创新
课程一：理想中的二维液相色谱系统——疫苗研究的创新
Alexander Schwenger 是德国 CureVac AG 的 EPD物理化学经理。 他在斯图加特大学获得博士学位。
课程二：液相色谱新技术在核酸疫苗研发中的应用-提纯
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课程三：液质联用平台在 mRNA 疫苗表征及质控中的应用
课程三：液质联用平台在 mRNA 疫苗表征及质控中的应用
课程四：使用自动LC-MS工作流程表征mRNA治疗药物
课程四：使用自动LC-MS工作流程表征mRNA治疗药物
课程五：Automated workflow for mRNA sequencing by high resolution LCMS
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课程六：液相色谱耗材技术在基因治疗和预防药物中的表征
课程六：液相色谱耗材技术在基因治疗和预防药物中的表征
只需30秒简单注册，即可解锁上述所有mRNA课程。
目前获批上市的疫苗佐剂多数集中在微小颗粒或纳米颗粒，包括铝盐、乳剂、脂质体和病毒载体。
脂质体主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构，可包裹多种疫苗，并有效地将抗原送至细胞对应靶点。其作用机制与铝佐剂相似，具有储存库效应，并可以增强抗原递呈细胞（APC）对抗原的摄入。
由上述介绍可以看出，大部分佐剂都没有紫外吸收，CAD电雾式检测器较传统紫外检测器、ELSD检测器等有着独特的优势，分析物既不需要发色团也不需要离子化，适用于不挥发及半挥发化合物的高灵敏度检测。
CAD检测器有更高的灵敏度、更宽的线性范围、更好的重现性成为新冠mRNA疫苗质量控制的首选。本实验利用Vanquish Flex液相色谱系统和Charged Aerosol Detector H电雾式检测器来分析疫苗中的佐剂。
色谱图：
系统适用性色谱图
实验结果与讨论:
PEG(聚乙二醇)、Chol(胆固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)以及两种自制佐剂在0.25 µg/ml～50 µg/ml范围内线性良好，相关系数R2 >0.999。 本方法五种组分检测限为0.125 ppm(S/N=3)，定量限为0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色谱图
由实验结果可知，本方法利用CAD电雾式检测器直接检测疫苗中的脂质体载体，无需进行前处理，灵敏度高，分离度和重复性好。
样品前处理简单，样品经纯化水稀释后可直接进样分析。
制剂样品色谱图
新冠疫苗主流研发工艺
1. 前处理
Nuclease T1是一种真菌核酸内切酶，可切割鸟嘌呤残基后的单链RNA，具有较强的特异性，常用于核酸测序应用。但由于核酸内切酶效率很高，酶解时间较难控制，且传统的溶液酶解方法会使核酸酶残留在分析柱上造成污染。基于以上需求，赛默飞推出了一款前处理磁珠，将Nuclease T1酶固定在磁珠上，通过简单快速的磁铁吸附及可有效控制酶解时间，并去除溶液里的T1酶，该方式可以有效提高实验的重现性并降低酶的干扰（如下图）。
有离线及在线两种方式可供选择：a) 将样品配成200 μL体积放于eppendorf管中（如下图a所示），置于酶解仪中震荡孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通过磁铁吸附的方式将酶解上清与磁珠分离，再加入1%甲酸终止反应；b) 采用全自动磁珠纯化仪，反应、分离及纯化均可根据设置好的程序进行自动操作，适用于高通量前处理需求（图b）。
图a:手动前处理示意图
图b: 全自动化在线前处理示意图
反应条件的优化：
a. 反应时间：酶解时间控制在5min 内，随着反应时间的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆盖度明显降低。对于修饰mRNA（如甲基化修饰），需要增加反应时间至30min.
b. 反应温度：37℃与50℃的结果类似
2. 色谱柱
色谱分离采用一款专用于核酸分析的色谱柱，Thermo Scientific™ DNAPac™ RP，该色谱柱由球形宽孔径 4 µm 聚合树脂构成，可耐受极端 pH (0-14) 和温度 (5-110°C) 条件，在HPLC 和UHPLC仪器上均可使用，针对寡核苷酸可实现高分辨率和高通量，较小和极大的核酸链均可分辨(如下图A)。图B显示DNAPac™ RP色谱柱的各类型号，mRNA mapping建议选用2.1*100 mm型号。
图 A
图 B
3. 液相系统
核酸样品吸附性强，而生物惰性液相系统吸附低；其次离子对试剂易腐蚀液相系统管路及接口，因此建议使用生物兼容的Vanquish UHPLC系统。
液相方法如下图：
4. 质谱
新一代Orbitrap Exploris系列产品具有体积小、性能高、操作简单等优势，扩展了Q Exactive系列质谱仪器的分析能力。如下图a所示，内置的AcquireX数据采集工作流程，为各种不同类型的应用设置参数模板，一键调用，可进行全面自动化的样品分析；且带有EASY IC离子源内标校正，保证仪器的高质量精度；更快的扫描模式可提高样品分析通量。图b显示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一级采用120，000分辨率，二级30，000分辨率；负离子扫描模式；stepped NCE 25,28,31 (优化后的能量，适用于mRNA mapping). 该方法模板可一键调用，操作简便，且得到高质量的谱图。
5. 数据分析软件
Biopharma Finder软件可实现核酸样品自动化数据分析，如下图a所示，软件支持DNA及RNA样品序列管理，可自定义核酸骨架和可变修饰，操作简便；对二级谱图进行自动化注释和解析；寡核苷酸杂质定性和相对定量分析；多批次样品含量变化趋势比对。图b 展示定结果图表，列表里的每一行代表一条鉴定的核酸链，右上方对应的理论及实测二级图谱，将图谱里响应很低的峰放大，可以清楚的看到碎片离子的同位素峰，结果可信度高。
图 a
图 b
Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基础上增加了长链mRNA mapping的功能，在数据处理方法中增加核酸酶模块，有常见的几种酶供选择，也可自定义添加酶。下图展示mapping分析结果，对于mRNA样品中每一条确证序列的片段，均可溯源详细信息，如在序列中的位置、一级和二级谱图、可信度、定量信息等。对于长度3900nt的mRNA样品，在该分析流程下，仅用RNAse T1酶解，即可获得98.5%序列覆盖度结果。
得益于Orbitrap仪器采集的高质量图谱，在核酸分析结果里几乎每一条链都可实现100%序列覆盖（Average Structural Resolution=1.0），这对于区分同分异构体非常有帮助。前面我们提到mRNA由4个特定碱基构成，在其酶解片段中出现同分异构是常见的现象，如下图，当仪器检测到足够多的碎片离子，可以确证同分异构的两条链里的每一个碱基，即可轻松区分两条分子量相同，序列不同的片段。
对于长链RNA片段，如下图具有13个漏切位点，48个碱基长度的片段，也可鉴定到每一个碱基，得到高可信度结果。酶解片段越长，其序列特异性越强，对于RNaes T1酶解无法覆盖的短片段，也可采用mazF酶解得到的更长片段作为互补信息。
案例分享：
编码新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)样品分析，首先用反相离子对色谱检测mRNA样品纯度，如下图a所示。采用上述mRNA mapping分析平台，从前处理到液质表征分析，得到如下结果：图b显示mRNA样品经过RNase T1酶解后的总离子流图，由于部分酶解，得到的片段较长，具有高特异性；与理论碱基序列匹配，在严格的数据筛选条件下，可得到98.5%的序列覆盖度。
图 a
图 b: Spike Protein mRNA digested with T1
图 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨质谱核酸分析平台，可以实现mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、杂质鉴定及定量等功能，为疫苗开发和质控提供更精确可靠的数据。
参考文献：
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500−8506 (2019)
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脂质体主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构，可包裹多种疫苗，并有效地将抗原送至细胞对应靶点。其作用机制与铝佐剂相似，具有储存库效应，并可以增强抗原递呈细胞（APC）对抗原的摄入。
由上述介绍可以看出，大部分佐剂都没有紫外吸收，CAD电雾式检测器较传统紫外检测器、ELSD检测器等有着独特的优势，分析物既不需要发色团也不需要离子化，适用于不挥发及半挥发化合物的高灵敏度检测。
CAD检测器有更高的灵敏度、更宽的线性范围、更好的重现性成为新冠mRNA疫苗质量控制的首选。本实验利用Vanquish Flex液相色谱系统和Charged Aerosol Detector H电雾式检测器来分析疫苗中的佐剂。
色谱图：
系统适用性色谱图
实验结果与讨论:
PEG(聚乙二醇)、Chol(胆固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)以及两种自制佐剂在0.25 µg/ml～50 µg/ml范围内线性良好，相关系数R2 >0.999。 本方法五种组分检测限为0.125 ppm(S/N=3)，定量限为0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色谱图
由实验结果可知，本方法利用CAD电雾式检测器直接检测疫苗中的脂质体载体，无需进行前处理，灵敏度高，分离度和重复性好。
样品前处理简单，样品经纯化水稀释后可直接进样分析。
制剂样品色谱图
新冠疫苗主流研发工艺
1. 前处理
Nuclease T1是一种真菌核酸内切酶，可切割鸟嘌呤残基后的单链RNA，具有较强的特异性，常用于核酸测序应用。但由于核酸内切酶效率很高，酶解时间较难控制，且传统的溶液酶解方法会使核酸酶残留在分析柱上造成污染。基于以上需求，赛默飞推出了一款前处理磁珠，将Nuclease T1酶固定在磁珠上，通过简单快速的磁铁吸附及可有效控制酶解时间，并去除溶液里的T1酶，该方式可以有效提高实验的重现性并降低酶的干扰（如下图）。
有离线及在线两种方式可供选择：a) 将样品配成200 μL体积放于eppendorf管中（如下图a所示），置于酶解仪中震荡孵育（37-50℃, 2000 rmp）5min ，通过磁铁吸附的方式将酶解上清与磁珠分离，再加入1%甲酸终止反应；b) 采用全自动磁珠纯化仪，反应、分离及纯化均可根据设置好的程序进行自动操作，适用于高通量前处理需求（图b）。
图a:手动前处理示意图
图b: 全自动化在线前处理示意图
反应条件的优化：
a. 反应时间：酶解时间控制在5min 内，随着反应时间的增加（30min, 1h, 4h, overnight），序列覆盖度明显降低。对于修饰mRNA（如甲基化修饰），需要增加反应时间至30min.
b. 反应温度：37℃与50℃的结果类似
2. 色谱柱
色谱分离采用一款专用于核酸分析的色谱柱，Thermo Scientific™ DNAPac™ RP，该色谱柱由球形宽孔径 4 µm 聚合树脂构成，可耐受极端 pH (0-14) 和温度 (5-110°C) 条件，在HPLC 和UHPLC仪器上均可使用，针对寡核苷酸可实现高分辨率和高通量，较小和极大的核酸链均可分辨(如下图A)。图B显示DNAPac™ RP色谱柱的各类型号，mRNA mapping建议选用2.1*100 mm型号。
图 A
图 B
3. 液相系统
核酸样品吸附性强，而生物惰性液相系统吸附低；其次离子对试剂易腐蚀液相系统管路及接口，因此建议使用生物兼容的Vanquish UHPLC系统。
液相方法如下图：
4. 质谱
新一代Orbitrap Exploris系列产品具有体积小、性能高、操作简单等优势，扩展了Q Exactive系列质谱仪器的分析能力。如下图a所示，内置的AcquireX数据采集工作流程，为各种不同类型的应用设置参数模板，一键调用，可进行全面自动化的样品分析；且带有EASY IC离子源内标校正，保证仪器的高质量精度；更快的扫描模式可提高样品分析通量。图b显示mRNA mapping的方法模板：在peptide mode模式下，一级采用120，000分辨率，二级30，000分辨率；负离子扫描模式；stepped NCE 25,28,31 (优化后的能量，适用于mRNA mapping). 该方法模板可一键调用，操作简便，且得到高质量的谱图。
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图 a
图 b
Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基础上增加了长链mRNA mapping的功能，在数据处理方法中增加核酸酶模块，有常见的几种酶供选择，也可自定义添加酶。下图展示mapping分析结果，对于mRNA样品中每一条确证序列的片段，均可溯源详细信息，如在序列中的位置、一级和二级谱图、可信度、定量信息等。对于长度3900nt的mRNA样品，在该分析流程下，仅用RNAse T1酶解，即可获得98.5%序列覆盖度结果。
得益于Orbitrap仪器采集的高质量图谱，在核酸分析结果里几乎每一条链都可实现100%序列覆盖（Average Structural Resolution=1.0），这对于区分同分异构体非常有帮助。前面我们提到mRNA由4个特定碱基构成，在其酶解片段中出现同分异构是常见的现象，如下图，当仪器检测到足够多的碎片离子，可以确证同分异构的两条链里的每一个碱基，即可轻松区分两条分子量相同，序列不同的片段。
对于长链RNA片段，如下图具有13个漏切位点，48个碱基长度的片段，也可鉴定到每一个碱基，得到高可信度结果。酶解片段越长，其序列特异性越强，对于RNaes T1酶解无法覆盖的短片段，也可采用mazF酶解得到的更长片段作为互补信息。
案例分享：
编码新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)样品分析，首先用反相离子对色谱检测mRNA样品纯度，如下图a所示。采用上述mRNA mapping分析平台，从前处理到液质表征分析，得到如下结果：图b显示mRNA样品经过RNase T1酶解后的总离子流图，由于部分酶解，得到的片段较长，具有高特异性；与理论碱基序列匹配，在严格的数据筛选条件下，可得到98.5%的序列覆盖度。
图 a
图 b: Spike Protein mRNA digested with T1
图 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨质谱核酸分析平台，可以实现mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、杂质鉴定及定量等功能，为疫苗开发和质控提供更精确可靠的数据。
参考文献：
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500−8506 (2019)