用于 Pyrosequencing™ 的单链模板

Pyrosequencing™ 的 PSQ 96 系统用于分析大量中短长度的 DNA 序列。

这种广泛应用的测序技术 (1) 由皇家理工学院（瑞典斯德哥尔摩）开发，于1999年由 Pyrosequencing AB（现称为 Biotage AB）商业化。其专利技术的优势在于能够快速生成序列数据，且具有高准确度 (>99%) 和重现性 (>99%)。边合成边测序意味着无需标记引物、标记核苷酸或凝胶电泳。从样本制备到获得分析结果的整个过程可在2小时内完成，并且可轻松实现自动化。

在单个反应管中，利用酶级联系统测定不断延伸的 DNA 链的核苷酸组分（图1）。使用四种不同的酶—DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、萤火虫荧光素酶和磷酸酶。

首先，将单链 DNA 模板与测序引物杂交，并连同两种底物腺苷 5’磷酰硫酸 (APS) 和荧光素与酶混合。然后将四种核苷酸之一 (dNTP) 加入反应。如果核苷酸与模板链的碱基互补，则 DNA 聚合酶会将其融合到延伸链中。焦磷酸盐 (PPi)（摩尔浓度与融合的核苷酸浓度相同）释放，并在 APS 存在的条件下经硫酸化酶转化为 ATP。

随后在 ATP 介导的情况下由荧光素酶将荧光素转化为氧化荧光素，利用在此过程中产生的可见光的量进行检测。任何未融合的核苷酸都会被三磷酸腺苷双磷酸酶降解，随后继续向管中加入核苷酸，重复上述级联反应。用 Pyrogram™ 检测光信号（图2），每个峰代表加入到 DNA 延伸链中的一个或多个相同碱基。

Pyrosequencing™ 需要单链测序模板。制备该模板较为简单的方法是使用 Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠（图3）。首先，使用其中一种生物素化引物对感兴趣 DNA 片段进行 PCR 扩增。然后，扩增子固定在磁珠上，用 NaOH 使非生物素化链变性。对 DNA 链依次进行洗脱和洗涤，去除其他所有反应组分后，加入测序引物并退火，以形成纯净的单链 DNA 模板。（可提供大包装折扣，详情请具体咨询。）

使用专为容纳96孔板而设计的磁力架可以同时手动制备多达96份样本。另外，现已开发出使用 Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠自动化制备样本的方案，这种方案在使用 Tecan MagS 站的 Tecan Genesis 150 工作站（TECAN AG，瑞士）上（图2和图4）以及在 Magnatrix 1200 工作站（Magnetic Biosolutions AB，瑞典）上都获得了不错的结果。

图 4.使用自动（上）和手动（下）制备的模板生成的裂解色谱图，用于 Pyrosequencing™ SNP 分析

Pyrosequencing™ 首先应用于各个研究领域的 SNP 分析 (3)。随后开始应用于其他各种应用领域。

使用 Pyrosequencing™ 实时测序技术可以快速获得中短长度的 DNA 序列（一般为 20-30 个碱基），因此它对疾病相关突变的鉴定 (4) 和基因组多样性分析 (5) 非常有帮助。致病因子的基因分型是利用该技术进行序列分析的另一个应用领域。

最近有报道称，利用该技术已成功完成人乳头瘤病毒 (6) 和幽门螺杆菌 (7) 的分型。在疾病治疗领域，使用 Pyrosequencing™ 技术来检测 HIV-1 蛋白酶抑制剂的抗性，从而对药物治疗进行监测 (8)。

1. Ronaghi M, Uhlén M and Nyrén P. A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate.Science 1998;281:363-365.
2. Blomgren P et al.Manual and automatic sample preparation for Pyrosequencing.Pyrosequencing AB poster.
3. Alderborn A, Kristofferson A and Hammerling U. Determination of single-nucleotide polymorphisms by real-time pyrophosphate DNA sequencing.Genome Res.2000;10(8):1249-1258.
4. Ahmadian A et al.Analysis of the p53 tumor suppressor gene by pyrosequencing.Biotechniques 2000;28(1):140-144.
5. Schiller AL et al.Accurate Allele Frequency Estimations of SNPs using Pyrosequencing.Pyrosequencing AB poster.
6. Gharizadeh B et al.Typing of human papillomavirus by pyrosequencing.Lab.Invest.2001;81(5):673-679.
7. Monstein H, Nikpour-Badr S and Jonasson J. Rapid molecular identification and subtyping of Helicobacter pylori by pyrosequencing of the 16S rDNA variable V1and V3 regions.FEMS Microbiol.Lett.2001;199(1):103-107.
8. O’Meara D et al.Monitoring resistance to human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitors by pyrosequencing.J. Clin.Microbiol.2001;39(2):464-473.

Figures 1, 2 and 4 are a courtesy of Pyrosequencing AB.Pyrosequencing™ and Pyrogram™ are trademarks of Pyrosequencing AB, Uppsala, Sweden.