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使用 Lipofectamine 3000 试剂将质粒 DNA 转染到 GCT 细胞中
适当的培养技术和程序是确保转染成功的重要组成部分。传代培养（也称为传代）是指移除培养基并将培养物中的细胞转移到新鲜的生长培养基中，从而实现细胞增殖。
转染前培养物中 GCT 细胞的明场图像。
完全生长培养基
| 成分 | 货号 |
|---|---|
| 含有 GlutaMAX 添加剂的 Gibco RPMI 1640 | 61870036 |
| 10% Gibco FBS | A3160401 |
| 25 mM Gibco HEPES (1 M) | 15630080 |
| 1.0 mM Gibco 丙酮酸钠 | 11360070 |
传代
- 将细胞置于 T-75 培养瓶中维持培养。
- 使用 Gibco TrypLE 解离试剂。
- 每 3-4 天进行一次细胞传代，以确保细胞尚未衰老。
- 应仅在解冻后第5代至第25代之间进行细胞转染。
- 如果设计的是涉及转染的实验，请确保设置与细胞传代一致。
- 在实验开始前1天铺板用于转染的细胞。
接种用于转染的细胞
- 转染前一天，对 T-75 培养瓶中汇合度达 80%-90% 的细胞进行解离处理。
- 使用标准台盼蓝拒染法进行细胞计数。
- 重要说明：根据所用的计数方法，测定的细胞数量和浓度可能存在显著差异；因此，在整个实验过程中保持一致并使用单一方法非常重要。
- 转染当天，细胞培养物中的细胞活力必须 >90%，且汇合度达到 80%。
- 重要说明：即使细胞未达到适当的汇合度，也勿等到第二天再进行转染，否则会显著影响转染效率。
- 对于24孔板的单个孔，加入 500 μL 生长培养基，从中接种 8.5 × 104 个细胞。
转染方案
| 成分 | 货号 |
|---|---|
| Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂 | L3000008 |
| Gibco Opti-MEM I 减血清培养基 | 31985062 |
| Thermo Scientific Nunc 经细胞培养处理的多孔细胞培养板，24孔 | 142475 |
在转染当天（即细胞铺板后1天）执行以下步骤，这些步骤已针对使用 Lipofectamine 3000 转染试剂处理24孔板的单孔进行了优化：
| 步骤 | 管 | 复合成分 | 用量/孔（24孔） |
|---|---|---|---|
| 1 | 管1 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| Lipofectamine 3000 试剂 | 0.5 μL | ||
| 2 | 管2 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| DNA 量（DNA 浓度应为 0.5–5 μg/μL） | 500 ng | ||
| P3000™ 试剂 | 1.0 μL | ||
| 3 | 将管2溶液加入管1中，混匀 | ||
| 4 | 将步骤3所得混合物在室温下孵育 10-15 min | ||
| 5 | 向细胞中加入 50 μL 步骤4所得复合物； 轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中 | ||
转染效率分析
在转染 GFP 报告基因构建体后 48 h，通过显微镜和流式细胞仪评价细胞。为了评估转染效率，首先通过荧光显微镜观察细胞，以定性评估蛋白表达、形态和活力（图1）。然后，通过吸出培养基并替换为 250 μL 由 TrypLE 试剂与 1X DPBS (7:3) 组成的混合物，制备用于流式细胞分析的细胞。将细胞置于 37℃ 下孵育 15 min，然后使用移液器上下吹吸，确保以单细胞状态进行流式细胞分析。
图1.细胞转染后分析。(A) 荧光和 (B) 明场图像显示，转染效率为 32%。
小贴士和技巧
- 转染时降低培养基中的血清含量（至 <10%）可以接受，但在转染后 4-24 h 内应替换为完全生长培养基。
- 转染过程中可使用抗生素。
- 流式细胞分析前，在明场显微镜下观察细胞，以核实细胞在与 TrypLE 试剂共同孵育后已呈解离状态。
- 如果15分钟后细胞仍未完全分离，则将其放回培养箱中再孵育 10-15 分钟。
- 当仅观察到部分附着或分离处理时间超过30分钟时，轻轻敲击平板侧面以帮助细胞分离。
扩大或缩小 Lipofectamine 3000 试剂转染规模
使用下表按比例缩放转染实验中各成分的用量。下面列出了最常见的实验规格。
| 培养容器 | 倍增系数* | 共用试剂 | DNA 转染 | siRNA 转染 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 生长培养基 | 用于制备复合物的 Opti-MEM 培养基 | DNA | P3000 试剂 | Lipofectamine 3000 试剂** | siRNA | Lipofectamine 3000 试剂** | ||
| 96孔 | 0.2 | 100 μL | 2 x 5 μL | 100 ng | 0.2 μL | 0.1 μL | 3 pmol | 0.3 μL |
| 48孔 | 0.5 | 250 μL | 2 x 12.5 μL | 0.25 μg | 0.5 μL | 0.25 μL | 7.5 pmol | 0.75 μL |
| 24孔 | 1 | 500 μL | 2 x 25 μL | 0.5 μg | 1 μL | 0.50 μL | 15 pmol | 1.5 μL |
| 12孔 | 2 | 1 mL | 2 x 50 μL | 1 μg | 2 μL | 1.00 μL | 30 pmol | 3 μL |
| 6孔 | 5 | 2 mL | 2 x 125 μL | 2.5 μg | 5 μL | 2.50 μL | 75 pmol | 7.5 μL |
| 60 mm | 11.05 | 5 mL | 2 x 250 μL | 5.5–11 μg | 11–22 μL | 5.50 μL | 166 pmol | 17 μL |
| 10 cm | 28.95 | 10 mL | 2 x 500 μL | 14–28 μg | 28–56 μL | 14 μL | 434 pmol | 43 μL |
| T-75 | 39.47 | 15 mL | 2 x 750 μL | 20–40 μg | 40–80 μL | 20 μL | 592 pmol | 59 μL |
| T-175 | 92.11 | 35 mL | 2 x 1.75 μL | 46–96 μg | 92–180 μL | 46 μL | 1,382 pmol | 138 μL |
| *确定最佳试剂用量后，使用倍增系数确定新平板规格所需的试剂用量。 **根据方案确定所需的 Lipofectamine 3000 转染试剂最佳用量。 | ||||||||
订购信息
Gibco 肺癌入门检测试剂盒
为方便您使用，此方案的基本成分现可在 Gibco 肺癌入门检测试剂盒中提供。该试剂盒包括：基础培养基、FBS、Lipofectamine 3000 试剂、Opti-MEM 培养基和 TrypLE 试剂。如需获取该试剂盒，请访问 thermofisher.com/cancercellculture。本方案所需的其他成分见下文订购表。
欲了解更多信息，请访问 thermofisher.com/3000
仅供科研使用，不可用于诊断目的。