适当的培养技术和程序是确保转染成功的重要组成部分。传代培养(也称为传代)是指移除培养基并将培养物中的细胞转移到新鲜的生长培养基中,从而实现细胞增殖。

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Brightfield image of GCT cells in culture, prior to transfection

转染前培养物中 GCT 细胞的明场图像。

完全生长培养基

成分货号
含有 GlutaMAX 添加剂的 Gibco RPMI 164061870036
10% Gibco FBSA3160401
25 mM Gibco HEPES (1 M)15630080
1.0 mM Gibco 丙酮酸钠11360070


传代

  • 将细胞置于 T-75 培养瓶中维持培养。
  • 使用 Gibco TrypLE 解离试剂。
  • 每 3-4 天进行一次细胞传代,以确保细胞尚未衰老。
  • 应仅在解冻后第5代至第25代之间进行细胞转染。
  • 如果设计的是涉及转染的实验,请确保设置与细胞传代一致。
  • 在实验开始前1天铺板用于转染的细胞。

接种用于转染的细胞

  • 转染前一天,对 T-75 培养瓶中汇合度达 80%-90% 的细胞进行解离处理。
  • 使用标准台盼蓝拒染法进行细胞计数。
    • 重要说明:根据所用的计数方法,测定的细胞数量和浓度可能存在显著差异;因此,在整个实验过程中保持一致并使用单一方法非常重要。
  • 转染当天,细胞培养物中的细胞活力必须 >90%,且汇合度达到 80%。
    • 重要说明:即使细胞未达到适当的汇合度,也勿等到第二天再进行转染,否则会显著影响转染效率。
  • 对于24孔板的单个孔,加入 500 μL 生长培养基,从中接种 8.5 × 104 个细胞。
     

转染方案

成分货号
Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂L3000008
Gibco Opti-MEM I 减血清培养基31985062
Thermo Scientific Nunc 经细胞培养处理的多孔细胞培养板,24孔142475

在转染当天(即细胞铺板后1天)执行以下步骤,这些步骤已针对使用 Lipofectamine 3000 转染试剂处理24孔板的单孔进行了优化:

步骤复合成分用量/孔(24孔)
1管1Opti-MEM I 培养基25 μL
Lipofectamine 3000 试剂0.5 μL
2管2Opti-MEM I 培养基25 μL
DNA 量(DNA 浓度应为 0.5–5 μg/μL)500 ng
P3000™ 试剂1.0 μL
3将管2溶液加入管1中,混匀
4将步骤3所得混合物在室温下孵育 10-15 min
5向细胞中加入 50 μL 步骤4所得复合物;
轻轻涡旋平板,确保复合物均匀分布至整个孔中

转染效率分析

在转染 GFP 报告基因构建体后 48 h,通过显微镜和流式细胞仪评价细胞。为了评估转染效率,首先通过荧光显微镜观察细胞,以定性评估蛋白表达、形态和活力(图1)。然后,通过吸出培养基并替换为 250 μL 由 TrypLE 试剂与 1X DPBS (7:3) 组成的混合物,制备用于流式细胞分析的细胞。将细胞置于 37℃ 下孵育 15 min,然后使用移液器上下吹吸,确保以单细胞状态进行流式细胞分析。

Fluorescence image demonstrating 32% transfection efficiency
bright-field image demonstrating 32% transfection efficiency

图1.细胞转染后分析。(A) 荧光和 (B) 明场图像显示,转染效率为 32%。

小贴士和技巧

  • 转染时降低培养基中的血清含量(至 <10%)可以接受,但在转染后 4-24 h 内应替换为完全生长培养基。
  • 转染过程中可使用抗生素。
  • 流式细胞分析前,在明场显微镜下观察细胞,以核实细胞在与 TrypLE 试剂共同孵育后已呈解离状态。
  • 如果15分钟后细胞仍未完全分离,则将其放回培养箱中再孵育 10-15 分钟。
  • 当仅观察到部分附着或分离处理时间超过30分钟时,轻轻敲击平板侧面以帮助细胞分离。

扩大或缩小 Lipofectamine 3000 试剂转染规模

使用下表按比例缩放转染实验中各成分的用量。下面列出了最常见的实验规格。

培养容器倍增系数*共用试剂DNA 转染siRNA 转染
生长培养基
用于制备复合物的 Opti-MEM 培养基
DNAP3000 试剂
Lipofectamine 3000 试剂**
siRNALipofectamine 3000 试剂**
96孔0.2100 μL2 x 5 μL100 ng0.2 μL0.1 μL3 pmol0.3 μL
48孔0.5250 μL2 x 12.5 μL0.25 μg0.5 μL0.25 μL7.5 pmol0.75 μL
24孔1500 μL2 x 25 μL0.5 μg1 μL0.50 μL15 pmol1.5 μL
12孔21 mL2 x 50 μL1 μg2 μL1.00 μL30 pmol3 μL
6孔52 mL2 x 125 μL2.5 μg5 μL2.50 μL75 pmol7.5 μL
60 mm11.055 mL2 x 250 μL5.5–11 μg11–22 μL5.50 μL166 pmol17 μL
10 cm28.9510 mL2 x 500 μL14–28 μg28–56 μL14 μL434 pmol43 μL
T-7539.4715 mL2 x 750 μL20–40 μg40–80 μL20 μL592 pmol59 μL
T-17592.1135 mL2 x 1.75 μL46–96 μg92–180 μL46 μL1,382 pmol138 μL
*确定最佳试剂用量后,使用倍增系数确定新平板规格所需的试剂用量。
**根据方案确定所需的 Lipofectamine 3000 转染试剂最佳用量。

订购信息

Gibco 肺癌入门检测试剂盒

为方便您使用,此方案的基本成分现可在 Gibco 肺癌入门检测试剂盒中提供。该试剂盒包括:基础培养基、FBS、Lipofectamine 3000 试剂、Opti-MEM 培养基和 TrypLE 试剂。如需获取该试剂盒,请访问 thermofisher.com/cancercellculture。本方案所需的其他成分见下文订购表。

欲了解更多信息,请访问 thermofisher.com/3000

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仅供科研使用,不可用于诊断目的。