유세포분석에서는 더 밝은 것이 항상 더 나은 것입니까?

유세포분석에서 더 밝은 것이 더 나은 것입니까?

Background를 증가시키지 않으면서 양성 및 음성 집단 간의 분리를 증가시킨다면 더 밝은 형광단(fluorophore)이 희귀 항원을 더 쉽게 관찰할 수 있게 합니다. 또한 단일 표적(즉, 레이저 1개, 검출기 1개, 항원 1개)만 있고 양성 집단의 평균 형광 강도(Mean Fluorescence Intensity, MFI)가 여전히 검출기의 동적 범위 내에 있는 경우(즉, 척도를 벗어난 것은 아님) 이들은 매우 유용합니다. 그러나 두 개 이상의 형광단(fluorophore)이 패널에서 결합되면, 더 밝은 형광단(fluorophore)의 이점이 약간 더 복잡해집니다. 각 염료-항체 콘주게이트(dye-antibody conjugate)에 대한 형광 특성을 고려하여 서로 어떤 영향을 미치는지 파악해야 합니다. 많은 형광단(fluorophore)은 여러 개의 검출기에서 빛을 방출하고/거나 여러 레이저에 의해 교차-여기(cross-excitation) 됩니다.

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가장 밝은 형광단(fluorophore)을 사용하는 경우 어떤 결과가 초래됩니까?

NovaFluor dye가 어떻게 도움이 됩니까?

가장 밝은 형광단(fluorophore)을 사용하는 경우 어떤 결과가 초래됩니까?

형광단(fluorophore)의 흡수 및 방출 스펙트럼을 플롯하면 스펙트럼 특성이 패널에 어떻게 영향을 미치는지 예측하는데 도움이 됩니다. 그림 1의 이미지는 PE-eFluor 610의 스펙트럼 예를 보여줍니다. 이 탠덤 염료(tandem dye)는 주로 황색 레이저 선에 의해 여기(excitation) 되지만, 또한 청색 레이저에 의해서도 상당히 많이 교차-여기됩니다. 마찬가지로, 이 염료는 일차 검출기(YL-2)에서 잘 방출되지만, YL-1처럼 다른 채널로도 상당한 스필오버(spillover)가 있습니다. 이와같이, PE-eFluor 610은 매우 밝아서 어두운 집단에 대한 분석에 매우 적합할 수 있습니다. 그러나, 이의 스필오버(spillover) 및 교차-여기(cross-excitation)는 패널에서 사용될 때 다른 검출기의 분해능을 감소시킬 수 있습니다.

그림 1. 두 이미지 모두 Attune NxT 유세포분석기, 청색/적색/자색/황색(V4)의 스탁 구성을 사용하여 Fluorescence SpectraViewer에서 조정되었습니다. PE-eFluor 610의 흡수 스펙트럼이 표준 자색(405nm), 청색(488nm), 황색(561nm) 및 적색(640nm) 레이저 선으로 중첩되었으며, 화살표는 일차 여기 소스로 황색 레이저를, 이차 여기 소스로 청색 레이저를 표시했습니다. 일차 여기 소스에서 얻은 PE-eFluor 610의 방출 스펙트럼은 일차 검출기 YL-2 (620/15) 및 이차 검출기 YL-1 (585/16)을 강조 표시하였습니다(오른쪽). PE-eFluor 610의 경우, 이차 검출기 YL-1으로 상당한 스필오버가 있습니다.

더 알아보기: Fluorescence SpectraViewer

패널에서 모든 항원에 대해 가능한 가장 밝은 형광단(fluorophore)을 사용하는 것이 좋은 아이디어 같지만, 문제가 발생하는 경우도 있습니다. 그림 2의 샘플 데이터는 밝은 것이 항상 더 좋은 것은 아니라는 예를 보여줍니다. 항원 밀도를 높이고 밝은 형광단(이 경우 PE)을 사용하여, 일차 검출기(YL-1)에서 밝기가 증가하고 이차 검출기로 확산되어 이 역시도 증가합니다(적색, 분홍색, 자색으로 표시). 더 밝은 콘주게이트의 증가된 확산으로 인해 공동-염색된 집단을 식별하기가 어려워집니다. 그러나, PE 콘주게이트의 밝기가 감소하면 분리가 더 유용하게 사용될 수 있습니다.

그림 2. 정상 인간 말초 혈액 세포를 Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal Antibody(카탈로그 번호 14-9161-73)로 4°C에서 15분 동안 처리한 후 지정된 항체 칵테일을 사용하여 염색하였습니다. 항체 칵테일은 CellBlox Blocking Buffer를 포함합니다. 향상된 결과를 위해 CellBlox Plus Blocking Buffer(카탈로그 번호 C001T06F01)를 권장합니다. 분석을 위해 림프구내 세포 게이트를 사용했습니다. 확산 증가를 보여주는 목적으로 CD8a는 가장 밝은 발현 세포(CD8a hi)에서 게이팅되었습니다. 데이터는 Attune NxT 유세포분석기, 청색/적색/자색/황색(V4)의 스탁 구성을 사용하여 수집되었습니다. 항원 밀도를 증가시키기 위해, BL-2 검출기로 보상된 PE(일차 검출기 YL-1)의 단일 염색 대조물질: 비염색 (흑색), CD197 (CCR7) Monoclonal Antibody (3D12), PE (카탈로그 번호 12-1979-42) (자색), CD27 Monoclonal Antibody (O323), PE (카탈로그 번호 12-0279-42) (분홍색), CD8a Monoclonal Antibody (SK1), PE (카탈로그 번호 12-0087-42) (적색). 각 집단의 옆에 보고된 YL-2 검출기의 MFI(즉, 밝기) 및 BL-2 검출기의 rSD(즉, 확산) (왼쪽). CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (DREG-56), NovaFluor Blue 585 (카탈로그 번호 H009T03B04) (흑색)을 포함하는 매치되는 공동-염색된 시료로 중첩된 CD197 (CCR7) PE(자색), CD27 PE(분홍색), CD8 PE(적색)의 단일 염색 대조물질 (오른쪽).

NovaFluor dye가 어떻게 도움이 될 수 있습니까?

확산으로 인한 분해능 부족을 극복할 수 있는 가장 좋은 방법은 스펙트럼이 선명한 형광단(fluorophore)을 사용하여 패널을 구성하는 것입니다. NovaFluor dye는 교차-여기 및 비표적 채널로의 스필오버를 감소시키도록 제조되었습니다. 그림 3에서, PE-eFluor 610을 스펙트럼이 더 선명한 형광단(fluorophore) 치환 제품인 NovaFluor Yellow 610과 비교하였습니다. 두 형광단(fluorophore)이 Attune에서 동일한 일차 검출기를 점유하고 있지만, NovaFluor Yellow 610은 청색 레이저에 의해 정규화된 교차 여기(Cross-excitation)가 거의 65% 감소하므로 PE-eFluor 610에 의해 가장 영향을 받는 이차 검출기인 BL-2로 방출이 감소합니다. PE-eFluor 610이 더 밝은 염료인 것을 고려할 때 이러한 교차-여기(cross-excitation)의 영향은 훨씬 큽니다.

그림 3. 두 이미지 모두 Attune NxT 유세포분석기, 청색/적색/자색/황색(V4)의 스탁 구성을 사용하여 Fluorescence SpectraViewer에서 조정되었습니다. 청색(488 nm) 및 황색(561nm) 레이저 선으로 중첩된 PE-eFluor 610(황색) 및 NovaFluor Yellow 610(주황색)의 흡수 스펙트럼(왼쪽). 청색 레이저(488nm)의 교차-여기로 인해 동일한 두 개의 형광단(fluorophore) 방출 프로파일이 표시되었습니다. 두 스펙트럼 모두 일차 여기 소스인 황색 561 nm으로 측정되었습니다. 황색 박스는 BL-2 검출기(590/40)를 나타냅니다(오른쪽).

더 밝은 PE-eFluor 610을 더 어둡고 선명한 NovaFluor Yellow 610으로 교체하면 이론적으로 스필오버(spillover)가 감소합니다. 이를 실제로 시험하기 위해, 각 형광단(fluorophore)을 동일한 항체에 콘주게이트하고 동일한 도너로부터의 동일한 세포를 염색하는 데 사용하였습니다. 그림 4에서, NovaFluor Yellow 610은 PE-eFluor 610에 비해 스필오버 및 확산이 상당히 적고, 비록 조금 더 어둡지만 NovaFluor Yellow 610 양성 집단을 여전히 쉽게 식별할 수 있습니다.

그림 4. 정상 인간 말초 혈액 세포를 Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal Antibody (카탈로그 번호 14-9161-73)로 4°C에서 15분 동안 처리한 후 지정된 항체 칵테일을 사용하여 염색하였습니다. 항체 칵테일은 CellBlox Blocking Buffer를 포함합니다. 향상된 결과를 위해 CellBlox Plus Blocking Buffer (카탈로그 번호 C001T06F01)를 권장합니다. 분석을 위해 림프구내 세포 게이트를 사용했습니다. 데이터는 Attune NxT 유세포분석기, 청색/적색/자색/황색(V4)의 스탁 구성을 사용하여 생성되었습니다. YL-2(일차) 및 BL-2(이차) 검출기에서 (A)보상되지 않은 그리고 (B) 보상된 CD4 Monoclonal Antibody (SK3), PE-eFluor 610 (카탈로그 번호 61-0047-42) (왼쪽 – 적색) 및 CD4 Monoclonal Antibody (SK3), NovaFluor Yellow 610 (카탈로그 번호 H001T03Y03) (오른쪽 – 청색). 양성 집단(직사각형 게이트로 표시됨) 비율은 오른쪽 상단 모서리에 보고되었습니다.

자세히 알아보기: 유세포분석 방법

역사적으로 더 밝은 형광단(fluorophore)이 어두운 집단을 검출할 수 있는 능력으로 칭찬받았습니다. 그러나, 이러한 기존 형광단(fluorophore) 중 일부는 비표적 형광으로 인해 상당한 스필오버 및 확산을 가집니다. 스필오버와 확산의 도입으로 패널 분해능이 감소되어 희귀하거나 어둡게 발현하는 항원, 특히 공동-발현 마커를 관찰하는 것이 어렵습니다. 스펙트럼이 더 선명한 콘주게이트를 사용하면 스필오버-확산을 감소시켜 분해능을 저하시키지 않으면서 더 큰 패널을 구성할 수 있습니다.