라텍스 비드 기술 개요

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무정형 중합체(대개 폴리스티렌)에서 콜로이드 크기 범위의 구형 중합체 입자인 라텍스 미세구가 형성됩니다.

직경 100nm 미만 입자의 경우 이 입자의 중합체 사슬의 평균 분자량은 약 1x10⁶g이고, 더 큰 입자의 경우는 약 2.4x10⁵g으로 감소합니다. 폴리스티렌 사슬은 두 번째 탄소원자마다 벤젠 고리가 연결된 선형 탄화수소 사슬입니다.

이 aromatic 고리는 사슬이 휘감고 얽히고 공간을 차지하는 방식을 통제합니다. 즉, 입자 표면의 모델은 모두 간헐적으로 사슬 말단이 튀어나와 있으면서 무작위로 쌓여 있는 벤젠 고리로 보일 수
있습니다.

따라서 표면은 그 특성상 소수성이 매우 강해 소수성 영역과 분자종의 물리적 흡착이 강합니다. 계면활성제와 단백질 분자는 단순한 수동 흡착으로 강하게 붙습니다.

이 그림은 폴리스티렌 미세구 일부의 표면을 나타낸 것입니다. 황산염기 위에서 표면을 내려다본 모습입니다. 벤젠 고리가 영역을 차지하고 단백질과 같은 물질의 흡착에 이상적인 강한 소수성 표면을 나타내는 방식에 주목해야 합니다. 중합체 사슬의 말단은 보통 하전된 기(charged group)로 이루어져 있으며, IDC의 UltraClean 라텍스 미세구의 콜로이드 안정성을 제공하고 이들이 응집되는 것을 방지합니다. 하전된 말단은 입자 표면적 중 5%-10%를 차지하므로, 라텍스 응집 검사에 사용되는 항체와 같은 다른 분자종을 배치할 수 있는 약 90%의 자유도가 허용됩니다.

폴리스티렌 속성

IDC의 UltraClean 라텍스 미세구는 계면활성제룰 필요로 하지 않아 응집이 방지됩니다. 깨끗한 표면은 흡착 및 안정성 실험에서 추측이나 짐작이 필요 없는 확실한 실험을 가능하게 해줍니다.

계면활성제 순도의 기준은 그리 엄격하지 않습니다. 대개 여러 제조원의 공급품은 변이가 클 뿐 아니라 배치(batch) 간 변동성도 매우 높습니다. 이러한 문제는 어쩔 수 없이 단백질 부착과 관련된 거동을 변화시킵니다.

추가적 문제계면활성제를 사용하는 제조원은 보통 최종 사용자에게 어떤 계면활성제를 사용했는지, 라텍스 분산에서 얼마나 남아 있는지에 대한 정보를 알려주려고 하지 않습니다. 일부 계면활성제는 입자 표면에 공유 결합할 수 있으며, 비이온 계면활성제에서 빈번하게 발생합니다. 이러한 경우 광범위한 투석이나 이온 교환 수지도 이 물질을 제거할 수 없습니다.

따라서 계면활성제가 없는 시스템으로 연구를 함으로써 이러한 문제를 해결하는 것이 바람직합니다. 특성이 잘 규명된 깨끗한 표면을 통해 분석을 최적화할 수 있습니다.

라텍스 미세구는 수성 현탁액에 잘 분산된 형태로 제공됩니다. 라텍스 미세구는 입자 사이에 작용하는 반데르발스 힘(van der Waals’ force)으로 인해 항체-항원 상호작용과 같은 특이적 원인이 없어도 응집합니다. 이러한 효과는 첨가제와 같은 역할을 합니다. 즉, 다수의 원자로 구성되어 있는 콜로이드 입자의 경우, 입자가 서로 인력(attraction)을 "감지"하는 거리는 최대 0.5 µm입니다.

두 라텍스 비드 사이의 인력(attraction) 이 그래프는 중합체 미세구가 서로 가까워질 때 두 입자를 분리하는 데 필요한 힘이 얼마나 커지는지를 보여줍니다. 작은 입자일수록 서로 당기는 힘은 약해지고 입자가 커질수록 인력이 커집니다. 이 인력은 입자 크기에 비례합니다. 이 입자를 분리하는 데 사용할 수 있는 열 에너지는 1kT뿐이며, 이것은 주위 에너지입니다. 이 입자를 계속 분리해 줄 장벽이 반드시 필요합니다. IDC의 UltraClean 입자는 합성 중 입자 표면에서 생성되는 전하를 활용합니다.다른 제조원은 주로 상세불명의 계면활성제 혼합물을 사용하고 있습니다.

두 라텍스 비드 사이의 반발력 Life Technologies의 입자 간 정전기 반발력은 입자들이 인력을 감지하는 거리와 비슷한 거리에서도 반발력을 "감지"할 정도로 충분히 강합니다.반발력은 표면과 가까운 전하로 인해 전위에서 계산되고, 이 전위는 제타전위(ζ-potential)로 알려져 있습니다. 이 제타전위는 실험을 통해 측정하거나 소수성 입자로 적정된 전하를 통해 추정할 수 있습니다.

두 라텍스 비드 사이의 총 상호작용 총 상호작용은 간단히 반발력에 인력을 더해 계산합니다. 1mM 염에서는 접촉하는 입자에 매우 큰 장벽이 있습니다. 염의 농도가 100mM로 높아지면, 이 장벽은 훨씬 낮아지지만, 여전히 충분히 안정적입니다. 염의 농도가 500mM 정도로 높으면, 입자는 응집합니다. 이렇게 높은 염도에서 이온 계면활성제는 안정성을 유지할 수 없으므로 비이온 계면활성제가 필요합니다. CML 카테고리와 같은 친수성 라텍스의 경우, 표면에 고정된 용해성 중합체 종(species)에서 구성된 "불분명한" 표면층으로 인해 추가적인 응집 장벽이 있습니다. 이 표면층은 실제로 농축 중합체 용액입니다. 두 표면층이 서로 밀면, 국소 삼투압 증가량은 큰 압축력을 견딜 수 있을 만큼 충분히 높습니다.

정전기적 반발력과의 총 상호작용 이렇게 강한 단거리 효과 외에도, 정전기적 반발력이 이 "불분명한" 층의 가장 바깥쪽 경계에서 시작됩니다. 정전기력에서 비롯된 이러한 이동의 최종 결과는 강해진 반발력입니다. 이러한 유형의 안정화는 정전기적 안정화로서 매우 강력합니다. 이 상호작용 유형은 자연계와 생물계에서 흔히 나타나는 현상으로 단백질성 표면층을 사용합니다. 우유의 지방 방울은 적혈구로 이러한 예에 해당됩니다.

“불분명한” 층의 크기는 pH와 염 농도의 함수입니다. pH가 증가하면, 이 층 내에 있는 카르복실기가 점점 더 해리되므로 이 층이 확장됩니다. 반면 염의 농도가 증가하면, 전하가 서로 점진적으로 스크리닝되므로 이 층은 다시 감소합니다. 그렇지만, 매우 높은 염 농도에서 중합체 층의 용해도는 감소하여 완전히 붕괴됩니다. 이제 입자 응집이 가능하므로 임계응고농도(Critical Coagulation Concentration, CCC)에 도달했습니다. 대개 친수성 라텍스의 경우, 이것은 1M 염화나트륨을 초과하므로 이 입자는 생리적 강도의 버퍼와 보다 쉽게 작용할 수 있습니다.

스토크스의 법칙(Stokes’ law)에 따른 단일 중합체 미세구 침전물. 이것은 침강 속도를 입자와 액체 사이의 밀도차, 입자 크기, 중력, 액체의 점성(viscosity)과 관련 지어 줍니다.

문제는 이러한 요소뿐 아니라 입자의 농도가 변할 수 있다는 점입니다. 중합체 미세구와 작용한 직후 1ìm 입자를 쉽게 원심분리할 수 있지만, 0.1ìm로는 훨씬 더 많은 어려움이 있습니다. 따라서 입자도 항상 움직이고 있다는 점을 인식하는 것 외에도 위의 인자 각각을 명심해야 합니다.

이제 이러한 인자 각각을 살펴 보겠습니다.

• 폴리스티렌의 밀도는 1.055g/ml로, 일반 실험실 온도에서 물의 밀도에 가깝습니다. 폴리스티렌의 팽창 계수가 매우 작으면 온도 변화로 인한 밀도 변화는 아주 크지 않습니다. 그러나 물은 크게 변화합니다. 예를 들어, 4°C에서 원심 분리를 할 경우, 입자는 실험실 온도에서 95%의 속도로 침강할 것입니다. 또한, 밀도는 염 농도의 함수입니다. 따라서 PBS의 생리적 농도에서 침강 속도는 최대 30%까지 느려질 수 있습니다.

• 점성(viscosity)은 밀도보다 훨씬 더 온도에 민감하고, 4°C에서 침강 속도는 25°C 침강 속도의 54%로 느려질 것입니다.

• 입자가 작을수록 침강 속도는 느려집니다. 예를 들어, 입자 크기가 1µm에서 0.1µm로 10배 감소하면, 침강 속도는 큰 입자 값의 1%로 느려집니다. 쉽게 말해, 5분 간의 원심분리가 아닌 약 8.5시간 동안 원심분리를 해야 합니다!

• 크기와 관련된 다른 문제는 입자가 고정되어 있지 않다는 것입니다. 즉, 입자는 국소적인 밀도 변동으로 인해 무작위 방식으로 확산됩니다. 이 브라운 운동(Brownian motion)은 광학 현미경으로 쉽게 관찰됩니다. 왜 이것이 문제가 되는 걸까요? 이러한 무작위 운동은 침강을 방해하기 때문입니다.

• 원심분리에서 속도를 높여 중력(g-force)을 증가시키면, 중력은 속도의 제곱으로 증가합니다. 아래 곡선은 단순한 폴리스티렌 황산염(Sulfate Polystyrene) 미세구의 전형적인 속도를 나타냅니다.

미세구 유형의 선택은 사용할 검사 유형과 단백질 부착 세부 사항에 따라 결정합니다. 예를 들어, 공유 결합을 사용할 경우, SuperActive 입자를 선택해야 하고 입자 크기는 검사 방법에 따라 달라집니다.

단순한 육안 검사: 고려할 요인으로는 좋은 시력, 확산 속도의 영향을 받는 빠른 반응, 사용 가능한 표면적입니다. 0.3µm-0.5µm의 크기는 육안으로 쉽게 확인할 수 있고 확산 속도도 빠릅니다. 또한, 단백질 흡착 면적이 비교적 큽니다. 그렇지만, 고밀도 입자를 사용하지 않을 경우 원심분리를 통한 세척은 어렵습니다. 특히 과도한 물질을 제거해야 하는 공유 결합계의 경우, 세척이 쉽다는 것은 1µm를 초과하는 입자 크기가 자주 사용됨을 의미합니다.

스트립 또는 막(membrane) 검사: 이러한 검사는 망(network)을 통과하는 확산 이동도가 높은 입자에 적합합니다. 따라서 약 0.25µm 크기가 적합합니다.

광 검출 검사: 혼탁도시험(trubimetric test)은 대개 직경이 0.15µm(상한)에 가까운 입자에 적합합니다. 이 보다 작은 크기에서 대상 입자의 응집은 빛의 산란을 현저히 증가시킵니다. 빛의 산란은 부피의 제곱에 비례하므로, 2중 입자는 단일 입자보다 4배 더 많이 산란됩니다. 그 결과, 작은 입자는 적절한 고체 농도(0.1%-1%)에서 사용될 수 있습니다.

훨씬 큰 입자에서 발생하는 빛의 산란 주위에서 사용할 수 있는 자동 검출 시스템도 설계되어 있습니다. 이 시스템은 1.5µm-5µm 입자를 사용하고 단일 입자의 산란 주위에서도 사용할 수 있습니다. 이렇게 큰 크기의 경우, ml당 개수는 1%의 고체로 매우 적습니다. 1% 고체에서 5µm 입자의 경우에는 ml당 6x10⁸ 개의 입자가 존재합니다(이에 비해 500nm 입자의 경우 6x10¹¹개이고 50nm 입자의 경우 6x10¹⁴개).