Ensayos de microplacas de fluorescencia

Directrices para realizar ensayos óptimos de microplacas basados en fluorescencia

1. Seleccione los filtros o longitudes de onda de excitación y emisión de fluorescencia óptimos. La información sobre la longitud de onda de excitación y emisión se proporciona en el manual del producto o en las tarjetas de revisión rápida. Si las coincidencias espectrales entre los reactivos y los instrumentos de detección son deficientes, se pueden producir grandes pérdidas de la señal.
2. Ajuste la sensibilidad del instrumento para maximizar la señal de fluorescencia. Para conseguir el máximo intervalo dinámico lineal, elija el parámetro más elevado de ganancia o sensibilidad que sea adecuado para los valores más altos y bajos previstos para el ensayo.
3. Utilice volúmenes de ensayo uniformes. Las pequeñas diferencias en el volumen de ensayo pueden causar grandes diferencias en la señal. Para obtener mediciones fiables, utilice siempre el menor volumen mínimo recomendado por el fabricante del instrumento.
4. Mezcle las muestras cuidadosamente. Una mezcla inadecuada puede provocar agregación, precipitación, variaciones en las tasas de reacción o diferencias en la concentración del analito o del reactivo de detección entre pocillos.
5. Evite la formación de burbujas. Las burbujas de las soluciones de ensayo producen difusión de luz y señales erróneas. Centrifugue brevemente la microplaca, degasifique las soluciones antes de la dispensación (pero no en los ensayos con células vivas) o rompa las burbujas grandes con una punta de pipeta.
6. Prepare muestras repetidas. El análisis de repeticiones aumenta la precisión de las mediciones.
7. Evite el «efecto borde». Para determinar la uniformidad de la señal de fluorescencia que se obtiene en los pocillos de la microplaca, se puede utilizar una solución de un fluoróforo con un espectro adecuado. Si se observan diferencias en la señal de los pocillos que se encuentran en los bordes de las microplacas, aplique un factor de calibración adecuado o evite utilizar esos pocillos.
8. Segregue las muestras brillantes. En las microplacas transparentes, las muestras muy fluorescentes pueden afectar a las señales que se observan en los pocillos colindantes (diafonía entre pocillos). Deje vacíos los pocillos situados junto a muestras muy fluorescentes o cargue las muestras con intensidades de fluorescencia similares en pocillos contiguos. Utilice microplacas blancas o negras en lugar de las transparentes.
   
9. Evite la decoloración fotográfica de las muestras. No vuelva a procesar las muestras a menos que sea absolutamente necesario. No vuelva a procesar los patrones, ya que algunos reactivos pueden producir una decoloración fotográfica considerable durante las mediciones de la fluorescencia.
10. Utilice concentraciones de muestras que se encuentren dentro del intervalo del ensayo. Para muestras desconocidas, pruebe con varias diluciones.