Kits Cells-to-C_T

Más información sobre la elección del kit RT-PCR de 1 o 2 pasos

La detección TaqMan suele ofrecer un protocolo más corto, mayor especificidad y sensibilidad, así como capacidad de multiplexar. Los métodos basados en colorantes SYBR Green se consideran a menudo más flexibles en cuanto a la gama de primers que pueden utilizarse y el coste suele ser menor.

Más información sobre la elección de un método de detección

Los nuevos kits Invitrogen Fast Advanced Cells-to-C_T ofrecen a los investigadores la capacidad de omitir por completo la purificación del ARN pasando directamente de las muestras de células cultivadas a la medición de la expresión génica relativa mediante RT-PCR (RT-qPCR) en tiempo real. Además, para mayor flexibilidad, los kits Cells-to-C_T están disponibles tanto en formato TaqMan como SYBR Green. Estos kits proporcionan un flujo de trabajo completo para el análisis RT-qPCR directamente de células cultivadas sin purificación de ARN. Ofrece un método exclusivo para lisar células cultivadas, extraer el ADN genómico (ADNg) y conservar la integridad del ARN, el kit contiene reactivos de transcripción inversa (RT) para la síntesis de ADNc y mezclas maestras TaqMan o SYBR Green para el análisis de PCR en tiempo real.

Dos formatos disponibles para una mayor flexibilidad

El nuevo kit TaqMan Fast Advanced Cells-to-C_T utiliza una enzima transcriptasa reversa mejorada que muestra mayor sensibilidad para detectar transcripciones raras o abundantes. Esto permite realizar análisis de expresiones directamente de células cultivadas sin purificación de ARN. Este kit ayuda a ahorrar tiempo y ofrece un flujo de trabajo sencillo que puede utilizarse con unas pocas muestras, pero también puede incorporarse fácilmente a aplicaciones automatizadas de alto rendimiento.

El kit TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT ofrece:

• Las mismas soluciones de lisis y de parada exclusivas que el kit de expresión génica TaqMan Cells-to-C_T original
• Especificidad superior para la detección de objetivos
• Facilidad y velocidad extraordinarias: 96 muestras para RT-qPCR en normalmente < 10 min
• Sin la tediosa purificación de ARN: sin columnas, calentamiento, centrifugación ni transferencia de muestras
• Rendimiento superior: con un diseño para una precisión, reproducibilidad y sensibilidad constantes con entre 10 y 100 000 células
• Flujos de trabajo de kits validados de primera calidad: conjuntos completos de reactivos preoptimizados para funcionar de manera eficaz desde el primer momento
• Detecta prácticamente cualquier producto genético con más de 2 millones de ensayos prediseñados
• Ensayos asequibles para casi todos los genes humanos, de ratones y ratas presentes en la base de datos RefSeq
• Disponible para 28 especies y algunos patógenos

El nuevo kit SYBR Green Fast Advanced Cells-to-C_T es un método rápido, sencillo y sólido para pasar directamente de las células cultivadas a los resultados de PCR en tiempo real. Esta tecnología contrastada de lisis celular y estabilización de ARN elimina por completo el laborioso y lento proceso de purificación de ARN. El kit se acciona mediante ADN polimerasas Applied Biosystems AmpliTaq Gold, LD (ADN bajo), que proporciona los niveles más elevados de especificidad con PCR estándar en tiempo real.

El kit SYBR Green Fast Advanced Cells-to-C_T ofrece:

• Las mismas soluciones de lisis y de parada patentadas que el kit de expresión génica TaqMan Cells-to-CT original
• Especificidad elevada para la detección de objetivos
• Facilidad y velocidad extraordinarias: 96 muestras para RT-qPCR en normalmente < 10 min
• Sin la tediosa purificación de ARN: sin columnas, calentamiento ni centrifugación
• Rendimiento superior: con un diseño para una precisión, reproducibilidad y sensibilidad constantes con entre 10 y 100 000 células
• Flujos de trabajo de kits validados productivos: conjuntos completos de reactivos preoptimizados para funcionar de manera eficaz desde el primer momento

Mayor sensibilidad en menos tiempo

La solución de parada Cells-to-C_T permite una mayor entrada de muestras en las reacciones de RT y qPCR posteriores, lo que aumenta notablemente la sensibilidad para la detección de objetivos raros. Ambos kits TaqMan y SYBR Green Fast Advanced Cells-to-C_T utilizan la solución de parada, lo que proporciona una excelente sensibilidad con un flujo de trabajo muy rápido. Estos kits son aproximadamente 48 veces más rápidos que la mayoría de kits de purificación de ARN de alto rendimiento. Los kits Fast Advanced Cells-to-C_T pueden procesar 96 o 384 pocillos a la vez; el flujo de trabajo experimental solo tarda unos 10 minutos para una placa de 96 o 384 pocillos. Los productos de otros proveedores utilizan una dilución y un pH bajos en sus flujos de trabajo, lo que restringe la cantidad de lisado celular que se puede utilizar en pasos posteriores.

Los kits Cells-to-C_T proporcionan un flujo de trabajo completo para el análisis de qRT-PCR en tiempo real directamente de células cultivadas sin purificación de ARN. Ofrece un método exclusivo para lisar células cultivadas, extraer el ADN genómico (ADNg) y conservar la integridad del ARN, el kit contiene reactivos de transcripción inversa (RT) para la síntesis de ADNc y mezclas maestras basadas en sondas (sondas TaqMan) o basadas en tintes (SYBR Green) para el análisis de PCR en tiempo real.

Los kits de 1 y 2 pasos difieren en que los kits de 1 paso combinan la transcripción inversa y la PCR en tiempo real en un solo paso, lo que reduce significativamente el número de pasos de pipeteo y el tiempo de protocolo.

Tanto si se utilizan placas como tubos, los kits Cells-to-C_T utilizan un sencillo procedimiento de preparación de muestras de entre 7 y 8 minutos que se describe a continuación (Figura 2). La tecnología de lisis está diseñada para 10-100 000 células cultivadas por muestra. Las células se lavan en PBS, a continuación, se lisan durante 5 minutos a temperatura ambiente; el tratamiento de ADNasa se puede realizar de forma simultánea. Para finalizar la lisis, las células se deben someter a un proceso de incubación de 2 minutos con solución de parada a temperatura ambiente. Los lisados ya están listos para el análisis en el instrumento de PCR en tiempo real o se pueden almacenar a - 20 °C durante un máximo de 5 meses. El flujo de trabajo del kit de 2 pasos continúa con la transcripción inversa para sintetizar el ADNc, después de lo cual las muestras de ADNc se pueden archivar o analizar directamente mediante qPCR en tiempo real.

Puesto que las muestras se pueden procesar directamente en pocillos de cultivo (96 o 384 pocillos), la manipulación de muestras y la posibilidad de pérdida de muestras o de error de transferencia se reducen al mínimo, lo que facilita un rápido procesamiento de alto rendimiento. A diferencia de los protocolos de aislamiento de ARN tradicionales compuestos por varios pasos, con este kit no es necesario llevar a cabo ningún paso de calentamiento, lavado o centrifugación. El kit simplifica en gran medida un laborioso proceso de 30-60 minutos y lo reduce a 7-8 minutos de tiempo de reacción, lo que permite el procesamiento de un cultivo celular completo de la muestra a la respuesta de qRT-PCR en tan solo 35 minutos (por ejemplo, el kit Cells-to-C_T 1-Step TaqMan).

Los kits de 2 pasos Fast Advanced Cells-to-C_T son más rápidos y prácticos de usar que la purificación de ARN tradicional sin poner en riesgo la sensibilidad. Dado que el flujo de trabajo se basa en lisados, no se produce pérdida de ARN con los kits Cells-to-C_T. En la purificación de ARN tradicional, una pequeña cantidad de ARN siempre se pierde debido a la elución incompleta de los filtros o los gránulos magnéticos. Por tanto, la capacidad de detectar ARN raros en muestras de células de entrada baja (10-1000) es mayor cuando las muestras se procesan con kits Cells-to-C_T en comparación con los resultados de las mismas muestras cuando se utilizan flujos de trabajo de purificación de ARN. Esto, junto con las ventajas que ofrece la solución de parada, proporciona a los flujos de trabajo Cells-to-C_T más sensibilidad que los kits de la competencia para detectar transcripciones de copias tanto abundantes como escasas.

Los kits Fast Advanced Cells-to-C_T incluyen un paso de preparación de muestras que se puede completar en menos de 10 minutos para 96 o 384 muestras. Los métodos de aislamiento de ARN de alto rendimiento, como los kits de gránulos magnéticos, pueden procesar 384 muestras, pero con una duración de protocolo de 3 horas*. Teniendo en cuenta que en una prueba de validación de objetivos de fármacos típica se procesan varias placas de 96 o 384 pocillos, comparamos el tiempo necesario para preparar 1536 muestras (es decir, 4 placas de 384 pocillos o 16 placas de 96 pocillos).

* basado en la duración del protocolo del kit de aislamiento de ARN total MagMAX mirVana

Todos los componentes de los kits Cells-to-C_T se han optimizado para ofrecer un rendimiento fiable y uniforme. Esto minimiza las conjeturas asociadas a la preparación de muestras separadas, la RT-PCR en tiempo real y las mezclas maestras.

Para una mayor garantía de calidad, el kit Cells-to-C_T 1-Step TaqMan se ha validado con ensayos de expresión génica TaqMan, y el kit Cells-to-C_T 1-Step Power SYBR Green se ha validado con un conjunto de primers para objetivos genéticos comunes. Ambos muestran un rendimiento equivalente al obtenido con ARN purificado (Figura 6).

Se comparó el kit de expresión génica TaqMan Cells-to-C_T con el de otros kits de lisados disponibles en el mercado y el del ARN purificado. Para ello, se examinaron 100-100 000 células por reacción de lisis. La sensibilidad del protocolo del kit TaqMan Cells-to-C_T fue equivalente a la que se obtuvo con el ARN purificado y superó a la de otros proveedores (Figura 7).

Para ayudarle a experimentar el poder de los resultados optimizados en diversas aplicaciones, también ofrecemos soluciones de instrumentación de PCR en tiempo real con las que completar su flujo de trabajo experimental. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real se utiliza para la detección y cuantificación específicas y sensibles de ácidos nucleicos diana. Hemos desarrollado potentes algoritmos de diseño de ensayo, mezclas maestras optimizadas, software intuitivo de análisis de datos e instrumentos flexibles para aprovechar la potencia de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) mediante un completo y variado conjunto de aplicaciones. Descubra soluciones para su investigación basada en qPCR.

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