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Como líder
La detección TaqMan suele ofrecer un protocolo más corto, mayor especificidad y sensibilidad, así como capacidad de multiplexar. Los métodos basados en colorantes SYBR Green se consideran a menudo más flexibles en cuanto a la gama de primers que pueden utilizarse y el coste suele ser menor.
Kits Fast Advanced Cells-to-CT | Kits Cells-to-CT | |||
---|---|---|---|---|
Un flujo de trabajo completo | Lisis → RT → qPCR | |||
Soluciones de lisis, ADNasa y parada Cells-to-CT | Sí | |||
Química de detección | Formato SYBR Green* | Formato TaqMan** | Formato SYBR Green* | Formato TaqMan** |
Tiempo de obtención de resultados | 95 min | 80 min | 120 min | |
Intervalo de trabajo | 10-100 000 células | 10-100 000 células | ||
Especificidad | Media† | Alta | Media† | Alta |
Sensibilidad (porcentaje máximo de muestra que llega a la reacción qPCR) | 13,5 % lisado | 20 % lisado | 20 % lisado | 20 % lisado |
Reproducibilidad | Media† | Alta | Media† | Alta |
Multiplexado | ||||
Ensayos prediseñados | ||||
Requiere normalmente diseño del usuario y optimización experimental | ||||
Expresión génica | Nivel medio de cuantificación | Nivel alto de cuantificación | Nivel medio de cuantificación | Nivel alto de cuantificación |
Aplicaciones |
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Detección |
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* La detección basada en SYBR Green utiliza colorante SYBR Green (un colorante de unión de ADN bicatenario) para detectar el producto de PCR conforme se acumula durante la PCR.
** La detección basada en TaqMan utiliza una sonda fluorogénica específica del gen objetivo para detectar el objetivo conforme se acumula durante la PCR.
† Los ensayos basados en SYBR Green requieren que los primers se diseñen y validen para garantizar la especificidad. La especificidad y la reproducibilidad dependen de la calidad de la plantilla y del diseño y la optimización de los primers.
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Kit Cells-to-CT 1-Step TaqMan | Kit Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green | |
Preparación de muestras de qPCR en 1 paso | Preparación de muestras de qPCR en 1 paso | |
Química de detección | TaqMan | SYBR Green |
Especificidad | Alta | Media* |
N.º de células en el paso de lisis | 10-100 000 células | 10-100 000 células |
Sensibilidad de detección | 1-10 copias | Variable* |
Reproducibilidad | Alta | Media* |
Purificación de ARN necesaria | No | No |
Tiempo de preparación (qRT-PCR) para 8 muestras | 7 min | 7 min |
Tiempo total (desde la lisis celular hasta los resultados de qRT-PCR) | 35 min | 1 h 23 min |
Multiplexado | ||
Archivado de ADNc | ||
Incluye mezcla maestra y de enzimas RT | ||
Incluye reactivos de preamplificación | ||
Adecuado para automatización | ||
Flexibilidad | Media | Media |
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Kit de qRT-PCR Single Cell-to-CT | |
Kit Single Cell-to-CT | |
Química de detección | TaqMan |
Especificidad | Alta |
N.º de células en el paso de lisis | 1-10 células |
Sensibilidad de detección | 1-10 copias |
Reproducibilidad | Alta |
Purificación de ARN necesaria | No |
Tiempo de preparación (qRT-PCR) para 8 muestras | 7 min |
Tiempo total (desde la lisis celular hasta los resultados de qRT-PCR) | 3 h |
Multiplexado | |
Archivado de ADNc | |
Incluye mezcla maestra y de enzimas RT | |
Incluye reactivos de preamplificación | |
Adecuado para automatización | |
Flexibilidad | Alta |
* Depende de la calidad de la plantilla y de la optimización de primers/diseño.
Kits Fast Advanced Cells-to-CT | Kits Cells-to-CT | |||
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Un flujo de trabajo completo | Lisis → RT → qPCR | |||
Soluciones de lisis, ADNasa y parada Cells-to-CT | Sí | |||
Química de detección | Formato SYBR Green* | Formato TaqMan** | Formato SYBR Green* | Formato TaqMan** |
Tiempo de obtención de resultados | 95 min | 80 min | 120 min | |
Intervalo de trabajo | 10-100 000 células | 10-100 000 células | ||
Especificidad | Media† | Alta | Media† | Alta |
Sensibilidad (porcentaje máximo de muestra que llega a la reacción qPCR) | 13,5 % lisado | 20 % lisado | 20 % lisado | 20 % lisado |
Reproducibilidad | Media† | Alta | Media† | Alta |
Multiplexado | ||||
Ensayos prediseñados | ||||
Requiere normalmente diseño del usuario y optimización experimental | ||||
Expresión génica | Nivel medio de cuantificación | Nivel alto de cuantificación | Nivel medio de cuantificación | Nivel alto de cuantificación |
Aplicaciones |
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Detección |
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* La detección basada en SYBR Green utiliza colorante SYBR Green (un colorante de unión de ADN bicatenario) para detectar el producto de PCR conforme se acumula durante la PCR.
** La detección basada en TaqMan utiliza una sonda fluorogénica específica del gen objetivo para detectar el objetivo conforme se acumula durante la PCR.
† Los ensayos basados en SYBR Green requieren que los primers se diseñen y validen para garantizar la especificidad. La especificidad y la reproducibilidad dependen de la calidad de la plantilla y del diseño y la optimización de los primers.
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Kit Cells-to-CT 1-Step TaqMan | Kit Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green | |
Preparación de muestras de qPCR en 1 paso | Preparación de muestras de qPCR en 1 paso | |
Química de detección | TaqMan | SYBR Green |
Especificidad | Alta | Media* |
N.º de células en el paso de lisis | 10-100 000 células | 10-100 000 células |
Sensibilidad de detección | 1-10 copias | Variable* |
Reproducibilidad | Alta | Media* |
Purificación de ARN necesaria | No | No |
Tiempo de preparación (qRT-PCR) para 8 muestras | 7 min | 7 min |
Tiempo total (desde la lisis celular hasta los resultados de qRT-PCR) | 35 min | 1 h 23 min |
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Incluye mezcla maestra y de enzimas RT | ||
Incluye reactivos de preamplificación | ||
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Flexibilidad | Media | Media |
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Kit de qRT-PCR Single Cell-to-CT | |
Kit Single Cell-to-CT | |
Química de detección | TaqMan |
Especificidad | Alta |
N.º de células en el paso de lisis | 1-10 células |
Sensibilidad de detección | 1-10 copias |
Reproducibilidad | Alta |
Purificación de ARN necesaria | No |
Tiempo de preparación (qRT-PCR) para 8 muestras | 7 min |
Tiempo total (desde la lisis celular hasta los resultados de qRT-PCR) | 3 h |
Multiplexado | |
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Incluye mezcla maestra y de enzimas RT | |
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Flexibilidad | Alta |
* Depende de la calidad de la plantilla y de la optimización de primers/diseño.
Los nuevos kits Invitrogen Fast Advanced Cells-to-CT ofrecen a los investigadores la capacidad de omitir por completo la purificación del ARN pasando directamente de las muestras de células cultivadas a la medición de la expresión génica relativa mediante RT-PCR (RT-qPCR) en tiempo real. Además, para mayor flexibilidad, los kits Cells-to-CT están disponibles tanto en formato TaqMan como SYBR Green. Estos kits proporcionan un flujo de trabajo completo para el análisis RT-qPCR directamente de células cultivadas sin purificación de ARN. Ofrece un método exclusivo para lisar células cultivadas, extraer el ADN genómico (ADNg) y conservar la integridad del ARN, el kit contiene reactivos de transcripción inversa (RT) para la síntesis de ADNc y mezclas maestras TaqMan o SYBR Green para el análisis de PCR en tiempo real.
El nuevo kit TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT utiliza una enzima transcriptasa reversa mejorada que muestra mayor sensibilidad para detectar transcripciones raras o abundantes. Esto permite realizar análisis de expresiones directamente de células cultivadas sin purificación de ARN. Este kit ayuda a ahorrar tiempo y ofrece un flujo de trabajo sencillo que puede utilizarse con unas pocas muestras, pero también puede incorporarse fácilmente a aplicaciones automatizadas de alto rendimiento.
El nuevo kit SYBR Green Fast Advanced Cells-to-CT es un método rápido, sencillo y sólido para pasar directamente de las células cultivadas a los resultados de PCR en tiempo real. Esta tecnología contrastada de lisis celular y estabilización de ARN elimina por completo el laborioso y lento proceso de purificación de ARN. El kit se acciona mediante ADN polimerasas Applied Biosystems AmpliTaq Gold, LD (ADN bajo), que proporciona los niveles más elevados de especificidad con PCR estándar en tiempo real.
La solución de parada Cells-to-CT permite una mayor entrada de muestras en las reacciones de RT y qPCR posteriores, lo que aumenta notablemente la sensibilidad para la detección de objetivos raros. Ambos kits TaqMan y SYBR Green Fast Advanced Cells-to-CT utilizan la solución de parada, lo que proporciona una excelente sensibilidad con un flujo de trabajo muy rápido. Estos kits son aproximadamente 48 veces más rápidos que la mayoría de kits de purificación de ARN de alto rendimiento. Los kits Fast Advanced Cells-to-CT pueden procesar 96 o 384 pocillos a la vez; el flujo de trabajo experimental solo tarda unos 10 minutos para una placa de 96 o 384 pocillos. Los productos de otros proveedores utilizan una dilución y un pH bajos en sus flujos de trabajo, lo que restringe la cantidad de lisado celular que se puede utilizar en pasos posteriores.
Figura 1. Volumen de lisado o reacción de RT en cada paso del flujo de trabajo. Los kits listos para usar en tiempo real son la principal competencia de nuestra actual gama de Cells-to-CT.
Figura 2. El procedimiento para el kit Fast Advanced Cells-to-CT es un proceso de 2 pasos que implica transcripción inversa y qPCR después de la lisis celular. Una reacción de 1 paso es cuando la RT y qPCR se realizan en un solo pocillo. En el paso de qPCR, los ensayos TaqMan utilizan combinaciones personalizadas de primers y sondas diseñadas para cada objetivo. Estos ensayos son más sensibles y específicos que los ensayos SYBR Green, que utilizan primers qPCR genéricos.
Los kits Cells-to-CT proporcionan un flujo de trabajo completo para el análisis de qRT-PCR en tiempo real directamente de células cultivadas sin purificación de ARN. Ofrece un método exclusivo para lisar células cultivadas, extraer el ADN genómico (ADNg) y conservar la integridad del ARN, el kit contiene reactivos de transcripción inversa (RT) para la síntesis de ADNc y mezclas maestras basadas en sondas (sondas TaqMan) o basadas en tintes (SYBR Green) para el análisis de PCR en tiempo real.
Los kits de 1 y 2 pasos difieren en que los kits de 1 paso combinan la transcripción inversa y la PCR en tiempo real en un solo paso, lo que reduce significativamente el número de pasos de pipeteo y el tiempo de protocolo.
Tanto si se utilizan placas como tubos, los kits Cells-to-CT utilizan un sencillo procedimiento de preparación de muestras de entre 7 y 8 minutos que se describe a continuación (Figura 2). La tecnología de lisis está diseñada para 10-100 000 células cultivadas por muestra. Las células se lavan en PBS, a continuación, se lisan durante 5 minutos a temperatura ambiente; el tratamiento de ADNasa se puede realizar de forma simultánea. Para finalizar la lisis, las células se deben someter a un proceso de incubación de 2 minutos con solución de parada a temperatura ambiente. Los lisados ya están listos para el análisis en el instrumento de PCR en tiempo real o se pueden almacenar a - 20 °C durante un máximo de 5 meses. El flujo de trabajo del kit de 2 pasos continúa con la transcripción inversa para sintetizar el ADNc, después de lo cual las muestras de ADNc se pueden archivar o analizar directamente mediante qPCR en tiempo real.
Puesto que las muestras se pueden procesar directamente en pocillos de cultivo (96 o 384 pocillos), la manipulación de muestras y la posibilidad de pérdida de muestras o de error de transferencia se reducen al mínimo, lo que facilita un rápido procesamiento de alto rendimiento. A diferencia de los protocolos de aislamiento de ARN tradicionales compuestos por varios pasos, con este kit no es necesario llevar a cabo ningún paso de calentamiento, lavado o centrifugación. El kit simplifica en gran medida un laborioso proceso de 30-60 minutos y lo reduce a 7-8 minutos de tiempo de reacción, lo que permite el procesamiento de un cultivo celular completo de la muestra a la respuesta de qRT-PCR en tan solo 35 minutos (por ejemplo, el kit Cells-to-CT 1-Step TaqMan).
Los kits de 2 pasos Fast Advanced Cells-to-CT son más rápidos y prácticos de usar que la purificación de ARN tradicional sin poner en riesgo la sensibilidad. Dado que el flujo de trabajo se basa en lisados, no se produce pérdida de ARN con los kits Cells-to-CT. En la purificación de ARN tradicional, una pequeña cantidad de ARN siempre se pierde debido a la elución incompleta de los filtros o los gránulos magnéticos. Por tanto, la capacidad de detectar ARN raros en muestras de células de entrada baja (10-1000) es mayor cuando las muestras se procesan con kits Cells-to-CT en comparación con los resultados de las mismas muestras cuando se utilizan flujos de trabajo de purificación de ARN. Esto, junto con las ventajas que ofrece la solución de parada, proporciona a los flujos de trabajo Cells-to-CT más sensibilidad que los kits de la competencia para detectar transcripciones de copias tanto abundantes como escasas.
Figura 3. Sensibilidad en comparación con otros kits. Se lisaron 104 células siguiendo el protocolo de cada kit. La cantidad máxima de lisado se añadió a la RT de cada kit (45 % para los kits Cells-to-CT y Fast Advanced Cells-to-CT; 10 % para el de otro proveedor). A continuación, se añadió un 25 % de la RT a las reacciones de qPCR de una matriz TaqMan para fosfodiesterasas, utilizando la mezcla maestra de qPCR de cada kit. El kit Fast Advanced Cells-to-CT mostró un rendimiento medio 0,5 Ct mejor que el kit Cells-to-CT original y 3,6 Ct mejor que el kit del otro proveedor (11 veces más sensible que el del otro proveedor).
Figura 4. Sensibilidad en comparación con otros kits. Se lisaron 104 células siguiendo el protocolo de cada kit. La cantidad máxima de lisado se añadió a la RT de cada kit (45 % para el kit Cells-to-CT original y el kit Fast Advanced Cells-to-CT; 10 % para el kit del otro proveedor). A continuación, se añadió un 25 % de la RT a las reacciones de qPCR de una matriz TaqMan para fosfodiesterasas, utilizando la mezcla maestra de qPCR de cada kit. Conclusiones: El kit Fast Advanced Cells-to-CT muestra un rendimiento medio 0,7 Ct mejor que el kit Cells-to-CT original y 4,7 Ct mejor que el kit del otro proveedor. Esto significa que el kit Fast Advanced es 14 veces más sensible que el kit del otro proveedor.
Figura 5. Comparación de detección. Se lisaron 104 células siguiendo el protocolo de cada kit. La cantidad máxima de lisado se añadió a la RT de cada kit (45 % para los kits Cells-to-CT y Fast Advanced Cells-to-CT; 10 % para el de otro proveedor). A continuación, se añadió un 25 % de la RT a las reacciones de qPCR para el kit del otro proveedor; se añadió un 30 % a la reacción de qPCR para el kit Fast Advanced Cells-to-CT y un 45 % para el kit Power SYBR. Se analizaron 10 genes diferentes. La mayoría de los genes no se detectaron en esta línea celular. De los genes detectados, el kit Fast Advanced Cells-to-CT tiene valores Ct más bajos que los otros kits para la mayoría de los genes.
Los kits Fast Advanced Cells-to-CT incluyen un paso de preparación de muestras que se puede completar en menos de 10 minutos para 96 o 384 muestras. Los métodos de aislamiento de ARN de alto rendimiento, como los kits de gránulos magnéticos, pueden procesar 384 muestras, pero con una duración de protocolo de 3 horas*. Teniendo en cuenta que en una prueba de validación de objetivos de fármacos típica se procesan varias placas de 96 o 384 pocillos, comparamos el tiempo necesario para preparar 1536 muestras (es decir, 4 placas de 384 pocillos o 16 placas de 96 pocillos).
* basado en la duración del protocolo del kit de aislamiento de ARN total MagMAX mirVana
Todos los componentes de los kits Cells-to-CT se han optimizado para ofrecer un rendimiento fiable y uniforme. Esto minimiza las conjeturas asociadas a la preparación de muestras separadas, la RT-PCR en tiempo real y las mezclas maestras.
Para una mayor garantía de calidad, el kit Cells-to-CT 1-Step TaqMan se ha validado con ensayos de expresión génica TaqMan, y el kit Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green se ha validado con un conjunto de primers para objetivos genéticos comunes. Ambos muestran un rendimiento equivalente al obtenido con ARN purificado (Figura 6).
Se comparó el kit de expresión génica TaqMan Cells-to-CT con el de otros kits de lisados disponibles en el mercado y el del ARN purificado. Para ello, se examinaron 100-100 000 células por reacción de lisis. La sensibilidad del protocolo del kit TaqMan Cells-to-CT fue equivalente a la que se obtuvo con el ARN purificado y superó a la de otros proveedores (Figura 7).
Figura 6. Sensibilidad y detección de secuencias objetivo limitadas mediante kits Cells-to-CT.(A) Sensibilidad de los ensayos de expresión génica con lisado frente a ARN purificado. Las células HeLa (10-100 000) se procesaron por triplicado utilizando el kit Cells-to-CT 1-Step TaqMan, o se purificó ARN mediante un método de columna de centrifugación de ARN. Cada conjunto de muestras se analizó mediante RT-PCR en tiempo real en el sistema de PCR en tiempo real 7900HT, para XENO y ACTB a partir del kit de control Cells-to-CT. (B) Detección de secuencias objetivo limitadas. Se agregaron cantidades cada vez mayores de células NIH3T3 (ratón) a 10 000 células HeLa. Las células se procesaron por triplicado con el kit de expresión génica TaqMan Cells-to-CT (procedimiento de 2 pasos) o reactivos purificados con un método de columna de centrifugación de ARN. Se realizó la transcripción inversa para genes específicos de ratón (B2M) y específicos de humanos (TKT) en reacciones por triplicado en un sistema de PCR en tiempo real 7900HT Fast.
Figura 7. Buena sensibilidad obtenida en ensayos de expresión génica TaqMan con lisados generados mediante el kit Cells-to-CT. Las células HeLa (100-100 000) se prepararon utilizando purificación de ARN tradicional, el kit de expresión génica TaqMan Cells-to-CT u otros métodos de lisado de los proveedores Q y S. Las reacciones de transcripción inversa se realizaron con la entrada de muestras máxima recomendada para cada kit, y la PCR en tiempo real se realizó por triplicado con un ensayo de expresión génica PPIA TaqMan.
Para ayudarle a experimentar el poder de los resultados optimizados en diversas aplicaciones, también ofrecemos soluciones de instrumentación de PCR en tiempo real con las que completar su flujo de trabajo experimental. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real se utiliza para la detección y cuantificación específicas y sensibles de ácidos nucleicos diana. Hemos desarrollado potentes algoritmos de diseño de ensayo, mezclas maestras optimizadas, software intuitivo de análisis de datos e instrumentos flexibles para aprovechar la potencia de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) mediante un completo y variado conjunto de aplicaciones. Descubra soluciones para su investigación basada en qPCR.
Si desea más información, visite thermofisher.com/quantstudioqpcrfamily
![]() | El kit de expresión génica TaqMan Cells-to-CT ha mostrado un rendimiento uniforme: El rendimiento aumenta en comparación con la purificación del ARN, los pasos de RT y, a continuación, la qRT-PCR. Hay menos manipulación y menos posibilidades de errores. Gracias al ahorro de tiempo y al aumento de la sensibilidad, he incorporado este protocolo en el Curso de formación sobre células madre embrionarias humanas del Centro de investigación con células madre de la Universidad Rutgers. | ![]() |
—Director del Centro de células madre | ||
![]() | La cuantificación de la expresión génica en células cultivadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR) suele implicar un paso de purificación de ARN que limita el procesamiento de la muestra y evita el análisis paralelo de un gran número de muestras. Un método en el que la síntesis de ADNc se lleva a cabo en lisados de células crudas y no en muestras de ARN purificadas puede ofrecer una alternativa rápida y sencilla. En este caso, evaluamos un enfoque de este tipo, comparando el Ambion Cells-to-CT con el flujo de trabajo clásico de purificación de ARN y síntesis de ADNc, y demostramos su buena precisión y su sensibilidad superior. | ![]() |
Los kits Invitrogen Cells-to-CT permiten medir la expresión génica relativa mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) sin necesidad de purificar el ARN antes de la amplificación.
Aprenda a preparar ARN para el análisis de expresión génica de células cultivadas en 7 minutos.
You get real-time PCR results in less time with the Invitrogen Cells-to-CT Kits. It is fast, easy and robust. Fewer handling steps ensure shorter protocol time, increased consistency, minimal sample loss and a reduced risk for contamination.
![]() | El kit de expresión génica TaqMan Cells-to-CT ha mostrado un rendimiento uniforme: El rendimiento aumenta en comparación con la purificación del ARN, los pasos de RT y, a continuación, la qRT-PCR. Hay menos manipulación y menos posibilidades de errores. Gracias al ahorro de tiempo y al aumento de la sensibilidad, he incorporado este protocolo en el Curso de formación sobre células madre embrionarias humanas del Centro de investigación con células madre de la Universidad Rutgers. | ![]() |
—Director del Centro de células madre | ||
![]() | La cuantificación de la expresión génica en células cultivadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR) suele implicar un paso de purificación de ARN que limita el procesamiento de la muestra y evita el análisis paralelo de un gran número de muestras. Un método en el que la síntesis de ADNc se lleva a cabo en lisados de células crudas y no en muestras de ARN purificadas puede ofrecer una alternativa rápida y sencilla. En este caso, evaluamos un enfoque de este tipo, comparando el Ambion Cells-to-CT con el flujo de trabajo clásico de purificación de ARN y síntesis de ADNc, y demostramos su buena precisión y su sensibilidad superior. | ![]() |
Los kits Invitrogen Cells-to-CT permiten medir la expresión génica relativa mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) sin necesidad de purificar el ARN antes de la amplificación.
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