ARNip transcrito in vitro

No limite su investigación con pruebas de solo unos pocos ARNip
Actualmente, se utilizan habitualmente ARN de interferencia pequeños (ARNip), compuestos de ARN bicatenario de ~ 21 bp con salientes de 3', para inducir el silenciamiento específico de genes a través de la vía de interferencia de ARN en células de mamíferos. Los ARNip más eficaces pueden reducir la expresión de genes diana en > 90 %. Lamentablemente, algunos ARNip tiene poco o ningún efecto. Para encontrar un ARNip que pueda inducir eficientemente reducción génica, lo habitual es diseñar y probar de 3 a 5 ARNip por gen. Así, los estudios que impliquen la reducción de varios genes diferentes requieren la síntesis y el ensayo de diferentes ARNip.

Reduzca los costos y el tiempo de preparación de ARNip
Si se utilizan ARNip sintetizados químicamente, los costos de un solo experimento pueden subir rápidamente. Además, los tiempos de procesamiento para ARNip personalizados suelen ser de varios días. El kit de construcción de ARNip Silencer™ produce ARNip listos para la transfección por una fracción del costo de la síntesis química. El kit se basa en un método de transcripción in vitro pendiente de patente y puede generar hasta 15 ARNip purificados en menos de 24 horas. El ahorro de coste y tiempo obtenido al usar el kit de construcción de ARNip Silencer permiten el cribaje de más genes y más objetivos posibles en su gen para encontrar el ARNip más potente.

Funcionamiento del kit
El método de transcripción in vitro que se incluye con el kit de construcción de ARNip Silencer utiliza ARN polimerasa T7 para generar filamentos individuales de ARNip. Las plantillas para las reacciones se producen a partir de dos oligonucleótidos de ADN económicos que codifican los filamentos de ARNip deseados. Estos oligonucleótidos están diseñados para incluir una secuencia de base 8 complementaria al extremo de 3' del primer promotor T7 incluido en el kit. Todos los oligonucleótidos se recuecen con el primer promotor T7 y una reacción de llenado con fragmento Klenow genera una plantilla bicatenaria lista para usar en la reacción de transcripción in vitro. Después de la transcripción, las reacciones se combinan para que se puedan recocer los filamentos de ARNip. A continuación, el preparado de ARNip se trata con ADNasa (para quitar la plantilla) y ARNasa (para pulir los extremos del ARN bicatenario) y, a continuación, se purifica la columna. Todo el procedimiento requiere muy poco tiempo y se puede completar en menos de 24 horas.

Una solución completa de síntesis de ARNip
El kit de construcción de ARNip Silencer incluye todos los reactivos necesarios para generar y purificar hasta 15 ARNip bicatenarios, listos para la transfección. También se incluye un manual de instrucciones detallado y una plantilla de control ARNip GAPDH. Los ARNip específicos de GAPDH realizados en la reacción de control pueden utilizarse para optimizar los protocolos de transfección.

Para identificar posibles secuencias diana en su ARNm, use nuestro buscador de objetivos de ARNip (en Ambion.com). Las secuencias diana resultantes pueden enviarse directamente a nuestra herramienta de diseño de plantillas para el kit de construcción Silencer para la generación de plantillas de oligonucleótidos necesarias para utilizar el kit. Como alternativa, puede ir directamente a la herramienta de diseño de plantillas (en Ambion.com) y pegar sus propias secuencias diana de ARNip.