Analizadores genéticos SeqStudio Flex

Amplification of DNA sequences by polymerase chain reaction (PCR) remains the workhorse for almost all aspects of molecular biology and genomic research.  There is an increasing need to analyze many targets in a single sample.  However, this can be tedious by PCR, involving setting up individual reactions for each of the desired targets.  Methods that can analyze multiple sequences from a single sample would simplify workflows and conserve precious samples.  One method to address this is fragment analysis by capillary electrophoresis (CE).  CE separates amplicons based on both size and fluor in a single capillary allowing a very large number of targets to be analyzed within a single sample.  

Multiplexed PCR coupled with fragment analysis presents a tremendous opportunity to perform complex analyses with minimal expense or effort.  Experiments are limited only by the ability to design primer sets against the targets of interest.  It can therefore be adapted and utilized in nearly any scenario where detection of many target sequences in a single sample is desired.  

This example demonstrates the power of multiplexed PCR by fragment analysis using a custom panel for detecting respiratory viral pathogens.  A panel of PCR primers containing 6-FAM labeling at the 5’-end were designed to detect 12 different respiratory RNA viruses, including rhinovirus, RSV-B, influenza A H1, influenza A H3, influenza B, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus OC43, and coronavirus 229E, as well as SARS-CoV-2 S, N, and orf1ab, so that each organism generated a different sized amplicon.  The resulting amplicons could be separated and examined using the SeqStudio, SeqStudio 24 Flex, or 3500xL genetic analyzers.

A menudo es necesario realizar una comprobación de calidad (CC) en un grupo de inicio de ADN bicatenario (ADNbc) antes de iniciar el análisis genómico o continuar con el siguiente paso. Por ejemplo, el ADN extraído del tejido conservado con FFPE puede estar fragmentado y ser demasiado pequeño para proporcionar información útil, por lo que es útil conocer el tamaño general antes de proceder.

El tamaño y la abundancia relativa de los fragmentos de ADNbc se pueden analizar en los analizadores genéticos de la serie SeqStudio Flex. En el protocolo, TOTO-1, un colorante fluorescente de intercalación de ADN, se incuba con una muestra, que se ejecuta a través del polímero POP7 con el calentador capilar apagado. (Esto mantiene el ADN en un estado bicatenario, no desnaturalizado). Al comparar la migración resultante de los fragmentos de prueba con la migración de los estándares conocidos de ADNbc, se puede determinar el tamaño de los fragmentos de prueba.

En esta prueba, evaluamos el rendimiento del analizador genético SeqStudio Flex y del analizador genético 3500xL para analizar varios tipos de muestras de ADN, incluidos dos estándares conocidos de ADNbc que se muestran en la figura. El panel A ilustra un análisis de ADN lambda de fago hidrolizado con HindIII, mostrando el patrón familiar de ocho fragmentos que van de 23.130 a 125 bp. El panel B muestra una mezcla de los mismos hidrolizados lambda HindIII con el fago phiX174 hidrolizado con BsuRI. Además de los ocho fragmentos lambda, se detectaron diez fragmentos más que oscilaron entre 1353 y 72 pb. Los perfiles obtenidos en los instrumentos SeqStudio Flex (izquierda) y 3500xL (derecha) eran bastante similares, validando los instrumentos más nuevos frente a la serie 3500.

Algunas investigaciones requieren información de secuencia específica para una región concreta de un genoma. Si bien las herramientas de descubrimiento para todo el genoma, como la NGS, proporcionan grandes cantidades de datos en regiones muy grandes, estos enfoques complejos no siempre se necesitan en la investigación centrada. La secuenciación de Sanger proporciona una solución sencilla, rentable y fácil de interpretar para la secuenciación de referencia de una región del genoma. 

Para demostrar la secuenciación centrada, secuenciamos la región del genoma del SRAS-CoV-2 que abarca la proteína espicular y las secuencias adyacentes, con base en investigaciones previas que identifican 12 pares de cebadores de secuenciación para todo el gen espicular del SARS-CoV-2. La región del gen espicular del SRAS-CoV-2 cubierta por los 12 amplicones superpuestos se extiende a lo largo de 5 kb.

En el panel A de la figura, los resultados de secuenciación de Sanger de alta calidad (indicados por la altura de las barras de color azul claro) se obtuvieron de casi los 12 amplicones en ambas direcciones, como se muestra en la figura.

Estos resultados se ensamblaron en una sola lectura de cóntigo del gen espicular del SARS-CoV-2. Las métricas de calidad de lectura eran casi idénticas en los tres analizadores. Una calidad de llamada de bases uniforme, tal como se demuestra aquí, permite que la secuenciación de Sanger ensamble la secuencia de regiones centradas utilizando amplicones de longitud media superpuestos, generando cóntigos que cubren un locus de interés.