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當起始材料為RNA時,可使用定量反轉錄PCR (RT-qPCR)進行分析。在這種方法中,RNA首先透過反轉錄酶(reverse transcriptase)從total RNA或messenger RNA(mRNA)轉錄成互補DNA(cDNA)。之後cDNA將作為qPCR反應的模板。RT-qPCR可用於各式應用,包括基因表現分析、RNAi驗證、微陣列驗證、病原體檢測、基因檢測和疾病研究。
RT-qPCR可以一步法(one-step)或者兩步法(two-step)檢測進行分析(圖1,表1)。一步法檢測同時運用反轉錄酶和DNA聚合酶,將反轉錄和PCR步驟結合於同一個試管與緩衝液中。一步法RT-qPCR僅使用序列特異性性引子。在兩步法檢測中,反轉錄和PCR步驟在各自的試管中進行,具備不同的優化緩衝液、反應條件與引子啟動策略。
圖1,一步法vs.兩步法RT-qPCR。
優點 | 缺點 | |
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兩步法 |
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當設計一個RT-qPCR檢測時,決定使用total RNA或是純化的mRNA作為反轉錄模板是很重要的。mRNA可能會提供稍高的靈敏度,但total RNA更常被使用,因為它作為起始材料而言比mRNA具有重要優勢。首先,因純化所需的步驟較少,而確保了更佳的模板定量回收,以及具備更好的能力將結果標準化為起始細胞數。其次,透過避免任何mRNA富集步驟,可以免除由於不同mRNA的回收率差異而導致結果偏差的可能性。綜合以上,total RNA在大部分情況下皆較適合使用,因為對於大多數應用而言,目標的相對定量比檢測的絕對靈敏度更為關鍵1。
在兩步法檢測中啟動cDNA反應可採用三種不同的方式:oligo (dT)引子、隨機引子,或序列特異性引子(圖2,表2)。通常情況下會使用oligo(dT)s和隨機引子的混合物。這些引子與模板mRNA鏈降溫黏合後,為反轉錄酶提供一個合成的起點。
引子選擇 | 結構與功能 | 優點 | 缺點 |
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Oligo(dT)s (或錨定oligo(dT)s)引子 | 胸腺嘧啶殘基與mRNA的poly(A)尾部降溫黏合後延伸;錨定oligo (dT)在3'末端含有一個G、C或A(錨定)殘基。 |
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隨機引子 | 長度為六到九個鹼基,它們沿著RNA轉錄本在多個位點進行降溫黏合。 |
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序列特異性引子 | 可針對特定mRNA序列設計客製化引子。 |
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反轉錄酶是以RNA為模板合成DNA的酶。某些酶具有RNase活性,可在轉錄後降解RNA-DNA複合體中的RNA鏈。如果一種酶不具備RNase活性,可以添加RNaseH以提高qPCR效率。常用的酶包括莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)反轉錄酶和禽類成髓細胞瘤病毒(Avian myeloblastosis virus)反轉錄酶。對於RT-qPCR來說,選擇具有高熱穩定性的反轉錄酶是最理想的,因為允許在更高溫的環境下進行cDNA合成,以確保成功轉錄具高品質二級結構的RNA,同時在整個反應過程中保持其完整活性,以達成更高的cDNA產量。
RNase H的活性將RNA從RNA-DNA雙螺旋中降解,從而有效合成雙股DNA。然而,對於較長的mRNA模板,RNA可能會過早地被降解,導致截斷的cDNA。因此,當目的在產生用於cDNA cloning的長轉錄本時,盡可能降低RNase H的活性通常是有益的。相較之下,具備內在RNase H活性的反轉錄酶在qPCR應用中時常受到青睞,因為它們在PCR的第一個循環中增強了RNA-DNA雙螺旋的熔解(圖3)。
理想情況下,用於RT-qPCR之qPCR步驟的PCR引子,應設計為可跨外顯子-外顯子接合處(exon-exon junction),且其中一個擴增引子可能跨越實際的外顯子-內含子邊界(圖4)。這種設計降低了因擴增污染的基因組DNA而造成的偽陽性風險,因為含有內含子的基因組DNA序列不會被擴增。
如果不能設計引子來分離外顯子或外顯子-外顯子邊界,則必須採用無RNase的DNase I或dsDNase來處理RNA樣品,以去除污染的基因組DNA。
所有的RT-qPCR實驗中都應包含一個減去反轉錄的對照組(-RT對照),以檢測是否有DNA污染(例如基因組DNA或前一次運作後的PCR產物)。這種對照組包含除了反轉錄酶以外的全部反應成分。在此對照中不應該發生反轉錄,因此如果觀察到PCR擴增,它很可能來自於污染的DNA。