HPLC 基礎知識

高效液相層析

高效液相層析方法是在 3-5 µm 的固定相顆粒上開發的，運作壓力高達 600 巴，流速在 1-2 mL/min 之間。標準 HPLC 是跨產業最廣泛使用的液相層析類型。

• 例行 HPLC 應用包括製藥、工業化學品和食品安全中，小分子和大分子的品質保證/品質控制。

超高效液相層析

超高效液相層析 (UHPLC) 方法是以 <2 µm 固定相顆粒為基礎，並在介於 600-1200 巴的壓力之間，以 0.2 – 0.7mL/min 流速運作。相較於標準 HPLC 系統，增加的壓力範圍可提供更佳的解析度和靈敏度、更高的通量，以及更少的溶劑用量。UHPLC 能讓使用者利用較小的管柱內徑和顆粒來擴充傳統 HPLC 的功能，並加快分析速度。

• UHPLC 的典型應用主要在研發實驗室以及製藥和生物製藥領域，用於小分子藥物、胜肽和抗體的開發和定性。

液相層析 - 質譜儀

液相層析儀質譜儀 (LC-MS) 使用質譜儀，而非像 UV-Vis 偵測器這類的傳統光學偵測器。此時會測量分析物的質荷比，而非光學性質。

• 胜肽與蛋白質分析是 LC-MS 方法中的例行性分析。

製備級液相層析

製備級LC 技術涉及  將分餾洗脫液收集到獨立樣本容器中分離出一種或多種分析物，以純化主要成分或分離雜質以供進一步研究。製備級 LC 分離分為三類：分析級、半製備級和製備級，分離的目標決定規模、 管柱尺寸和流速。

• 製備級 LC 分離用於大規模純化質量成分，通常用於製造目的。管柱的內徑通常介於 50-200 mm 之間，且流速為 >50 mL/min。 
• 半製備級 LC 應用範圍從用於製造的小規模純化到定性工作流程，例如用於結構分析的化合物分離。管柱的內徑為 10-30 mm，流速介於 5-50 mL/min。
• 分析級純化可用於上游和下游過程，例如提高產品產量或分離純化合物以進行低溫 EM 定性。管柱和流速分別低於 4.6 mm 和 2 mL/min。

二維液相層析

二維液相層析 (2D-LC) 是一種進階分離技術，使用連續兩個互補性管柱化學品進行多維分離，而非透過一根管柱分離樣本。層析操作人員可以使用三種獨特類型的 2D-LC 方法，藉由運用多管柱選擇性，協助改善樣本解析度。

• 2D-LC 可應用於複雜的化學混合物，例如含干擾樣本基質的疫苗和食物。

雙管液相層析

雙管液相層析 是一種多通道 HPLC 方法，在單一系統中使用兩個獨立的流路，以同時執行兩種分析。此類 HPLC 系統擁有具備兩個獨立溶劑路徑的兩個幫浦、自動進樣器內的兩個加液裝置和兩個偵測器，但仍維持單一 HPLC 系統的佔用面積。

• 雙管 LC 方法對於任何需要增加樣本通量的情況都很有幫助，例如在單次運作中分析樣本的殘留農藥和酚類含量，或同時進行重複分析。

串聯液相層析

串聯液體色階技術使用第二個幫浦和智慧型管柱切換，將因重置管柱所造成的停機時間降至最低，以達到偵測器的最高使用率。 串聯梯度運作分為兩個主要部分：在第一幫浦將分析梯度傳送至第一根管柱時，第二幫浦進行重新調節。然後第一幫浦將分析梯度輸送到第二根管柱，此時第二幫浦重新調節第一根管柱。

• 串聯 LC 方法最適合用在藥物開發實驗室的先導物選擇等應用，可增加樣本通量並最大化偵測器使用率。

反梯度液相層析

梯度洗脫過程中有機成分的變化會影響某些偵測器 (例如電霧式偵測) 的分析物反應，並使分析複雜化。在管柱後應用反梯度補償，可確保進入偵測器的洗脫液在整個梯度分離過程中具有相同的溶劑組成，而消除此種影響。

• 反梯度分離僅適用於使用電霧式偵測器時，並應用在製藥領域，此領域中定量藥物中的雜質至關重要。 

HPLC 的分離原理是以樣本化合物在移動相 (由幫浦驅動) 與固定相 (在管柱中) 之間的分佈為基礎。當通過管柱時，化合物基團與固定相的交互作用不同，並根據化學特性滯留，因此會發生分離。

幫浦會讓移動相流經裝有固定相的管柱。自動進樣器會將樣本注入管柱中。固定相可分離樣本化合物或分析物。偵測器會測量從管柱分離和洗脫出的分析物。