西方墨點法

術語"blotting"是指將生物樣品從凝膠轉移到印漬膜上，然後在膜的表面對其進行檢測。西方墨點實驗或western blotting（也稱為免疫印漬，因為透過抗體來特異性地檢測其抗原），由Towbin等人於1979年提出，現在已成為蛋白質分析的常規技術。由於抗體-抗原交互作用的特異性，實現在複雜的蛋白質混合物中識別目標蛋白。Western blotting可產生關於感興趣蛋白質的定性與半定量數據。

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Western blotting的第一步驟是使用凝膠電泳分離樣品中的大分子。隨後，將分離的分子轉移或印漬到第二個基質上，通常是硝化纖維素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。接下來，將印漬膜封閉以防止抗體於膜表面產生任何非特異性結合。轉移後的蛋白質最常被以一種抗體組合進行探測：一個是與興趣目標蛋白質具備特異性的抗體（一級抗體），搭配另一個與一抗的宿主物種擁有特異性的抗體（二級抗體）。二級抗體通常會與酶結合，當其與適當的受質結合時，將產生可供檢測的信號。呈色受質在印漬膜上產生沉澱，形成肉眼可見的色度改變。最靈敏的檢測方法為使用化學發光受質 ，該受質發光是抗體與酶結合反應後的副產物。光輸出可利用底片進行記錄。然而，以配載感光耦合元件（charge-coupled device，CCD）鏡頭的數位成像系統來捕捉化學發光信號，已逐漸成為受歡迎的底片替代品。或者，也可以採用螢光標記抗體，這需要能捕獲螢光信號的儀器進行檢測。螢光印漬是一種較新的技術，並且越來越受到歡迎，因為它提供了多重檢測的可能性（在單一印漬上檢測多種蛋白質）。無論使用何種系統，信號強度都應該與印漬膜上的抗原豐度相關。

西方墨點實驗檢測步驟的程序差異很大。一種常見的差異為直接檢測與間接檢測。在直接檢測方法中，使用酶-或螢光團-偶聯一級抗體來檢測印漬上的感興趣抗原。因為大多數研究人員原因各異而更偏好間接檢測方法，此種檢測方法並沒有被廣泛使用。在間接檢測方法中，首先使用未標記的一級抗體與抗原結合。隨後，使用酶-或螢光團-偶聯二級抗體來檢測一級抗體。標記物（或偶聯分子）包括生物素、螢光探針（如Invitrogen Alexa Flour或DyLight螢光團），以及酶共軛物（如辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）或鹼性磷酸酶(AP)）。與直接檢測方法相比，間接檢測方法具備許多優點，如下面所述。

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凝膠電泳，是一種將帶電的分子（如蛋白質或DNA）在電流作用下強制通過凝膠時，根據物理特性對其進行分離的技術。蛋白質通常會使用聚丙烯醯胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）進行分離，以確定複雜樣品中單一蛋白質的特性，或檢驗單一樣品中的多種蛋白質。當PAGE與western blotting結合使用時是一項強大的分析工具，可提供關於蛋白質質量、電荷、純度或存在種類等資訊。PAGE存在不同規格，可以提供有關感興趣蛋白質不同類型的資訊。例如，非變性PAGE或天然PAGE，可根據電白質的電荷質量比（mass-charge ratio）來對其進行分離。相較之下，十二烷基硫酸鈉-PAGE（sodium dodecyl sulfate-PAGE）或稱SDS-PAGE，則是根據質量分離蛋白質，這是由於蛋白質與離子型SDS洗滌劑結合後攜帶了負電荷。

幾種緩衝液系統或凝膠化學物質皆可用於蛋白凝膠電泳。在剖析不同分子量的蛋白質時，每個系統都各具獨特的優勢。

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電泳之後，蛋白質必須從凝膠轉移到印漬膜上。目前已有多種方法可使用於該過程，包括但不侷限於擴散轉移、毛細管轉移、真空印漬轉移和電泳溶離（electroelution）。考量速度和轉移效率，最常使用的蛋白質轉移方法是電泳溶離或電泳轉印。這種方法是利用蛋白質的電泳流動性將其從凝膠中轉移到印漬膜上。蛋白質的電泳轉印，包括將含蛋白質的聚丙烯醯胺凝膠，與一片硝化纖維素膜或其他適合與蛋白質結合的載體直接接觸，並將其"層疊夾入"並浸沒於導電溶液中的兩個電極之間。該過程包括使用多孔墊和濾紙來促進轉移。當施加電場時，蛋白質從聚丙烯醯胺凝膠中移動到膜的表面，在此處蛋白質變得緊密相連。實驗結果為印漬膜上獲得最初在聚丙烯醯胺凝膠中蛋白質原圖樣的複本。

根據蛋白質從凝膠移出的能力及其在特定條件下與印漬膜結合的傾向，不同蛋白質間的轉移效率可能會有顯著差異。轉移效率取決於凝膠的組成、凝膠與膜的完全接觸、電極的位置、轉印時間、蛋白質的大小和組成、電場強度，以及緩衝液中是否存在洗滌劑與酒精等因素。

Western blot轉印後以及繼續進行之前，可以用蛋白質染劑評估膜上的總蛋白質，以查驗轉移效率。也可以對凝膠進行染色以確認蛋白質是否已移出凝膠，但這並無法確保蛋白質與膜的有效結合。由於染劑可能會干擾抗體的結合和檢測，因此易於去除的蛋白質染劑最為理想。Ponceau S染劑是目前最廣泛使用的試劑，用於對膜上的蛋白質進行可逆性染色，儘管它的靈敏度有限，拍攝效果不佳且會迅速褪色，因而記錄困難。在硝化纖維素膜或PVDF膜上對蛋白質進行染色，現有更優質的替代品可供選擇，它們可以檢測量小至奈克（ng）等級的蛋白質，易於拍照，並且不會褪色直至移除。

可逆性蛋白質染劑與Ponceau S染劑的比較。每個凝膠皆已預染分子量（MW）標記物（Lane 1），未預染色的蛋白質分子量標記物經連續稀釋，並分別運行於4-20% Tris-glycine-SDS聚丙烯醯胺凝膠（Lane 2-10）。使用電泳溶離將蛋白質轉印到PVDF膜上。根據實驗手冊，使用Thermo Scientific Pierce可逆性染劑進行1分鐘（圖A）。同樣根據實驗手冊，使用0.1% Ponceau S在5%乙酸中進行5分鐘的印漬染色（圖B）。

目前幾種現存的電性轉印策略。最常見的方法是濕式、半乾式和乾式，每種方法在時間、成本以及所需的試劑和設備都有特殊考量。濕式轉印（被稱為槽轉印）提供了高轉印效率，緩衝系統與方法選擇的靈活性，但需要付出時間和精力。半乾式印漬可靈活運用多種類型的緩衝系統，既方便又節省時間。然而，半乾式印漬對於大分子量蛋白質(>300 kDa)的轉印效率較低。乾式轉印則提供了快速又方便的高品質轉印，因為不需要緩衝液，但在耗材方面的靈活度有限。

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與其他免疫分析程序一樣，西方墨點法由一連串不同的免疫化學試劑作用組成，這些試劑中間透過洗滌步驟分離。洗滌步驟是必要的，以去除未結合的試劑並降低背景值，從而提高訊噪比。洗滌不充分可能導致背景過高，而洗滌過度則可能導致抗體和/或抗原從印漬中洗脫，以致於靈敏度下降。與西方墨點法中的其他步驟一樣，各種緩衝液都是可用的。

Tris緩衝鹽水（TBS）和磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）是最常被使用的洗滌緩衝液。在大多數情況下，PBS和TBS緩衝液可以互換。但是，在某些情況下應選用其中一種，而非另一種。例如，當使用帶有鹼性磷酸酶（AP）結合二級抗體的系統時，或使用磷酸特異性抗體以檢測磷酸化蛋白質時，上述情況應使用TBS緩衝液。

偶爾洗滌緩衝液配方會包含清潔劑，如0.05% Tween 20，以幫助去除非特異性結合的物質。根據分析的具體情況，洗滌緩衝液中的清潔劑用量略有差異，然而Tween 20等清潔劑的常規濃度約為0.05至0.5 %。另一種常見的技術，是在洗滌緩衝液中添加1:10稀釋的封閉溶液。將封閉劑與清潔劑一同加入，可以防止已阻斷的蛋白質從印漬膜上洗脫，和/或允許與溶液中蛋白質而非固定於膜上的蛋白質發生非特異性交互作用，進而有助於將分析中的背景值最小化。

值得注意的是，清潔劑和蛋白質溶液一樣，會促進微生物成長。雖然製備NP-40、CHAPS和Tween 20等清潔劑的預稀釋庫存很方便，但真菌可以在這些溶液中生長，從而導致高背景雜訊。除此之外，清潔劑可能含有大量過氧化物，如使用辣根過氧化物酶受質時會產生背景信號。因此，使用高純度的清潔劑非常重要。

一般來說，在western blot中識別目標蛋白質的一級抗體是無法直接被檢測的。因此，使用被標記的二級抗體以最終對目標抗原進行檢測（間接檢測）。各式各樣的標記二抗可用於western blot檢測。二級抗體的選擇取決於生成一級抗體的動物物種（宿主物種），或與一抗相關的任何標籤（如生物素、組氨酸(His)、血凝素(HA)等）。舉例來說，如果一級抗體是未經修飾的小鼠單株抗體，那麼二抗必須是來自非小鼠宿主所獲得的抗小鼠IgG（或非IgG）二級抗體。

Western blotting的抗體通常會稀釋使用，製造商可能會建議將1 mg/mL的原液，進行1/100–1/500,000的稀釋範圍後使用。然而，指定抗體在一特定檢測系統中的最佳稀釋度，必須透過實驗過程來確定。與低靈敏度系統相比，靈敏度越高的檢測系統需要的抗體量越少，可節省大量抗體成本，並讓有限的抗體供應於更多的實驗中運用。使用較少量的抗體還具有降低背景的額外好處，因為有限的抗體量對具有最高親和力的目標顯示出更高的特異性。

抗體的稀釋通常在洗滌緩衝液中進行。抗體稀釋劑中清潔劑和少量封閉劑的存在，通常有助於將背景值降至最低，從而提高訊噪比。相反的，在抗體稀釋溶液中添加過多的封閉劑或清潔劑，會阻止抗體與抗原的有效結合，從而導致背景降低的同時，訊號也會跟著減弱。

延伸閱讀：作為探針的二級抗體
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雖然有許多不同的標記物可與二級或一級抗體相結合，但使用的檢測方法將限制western blotting分析中的使用選擇。過去廣泛使用放射性同位素，但因其價格昂貴、保存期限短、訊噪比無法改善，並且需要特殊處理和安置。目前的替代標記物是酶和螢光團。

酶標記法最常用於western blotting，雖然它們的步驟較多，但利用合適的受質進行優化後可能會極其靈敏。蛋白質檢測時最廣泛用於標記的兩種酶，是辣根過氧化物酶（HRP），和使用範圍稍小的鹼性磷酸酶（AP）。包含呈色、螢光和化學發光受質等系列都可與這兩種酶一起使用。鹼性磷酸酶與其他酶相比具有明顯優勢，因為其反應速率保持線性，透過更長的反應時間可輕鬆提高靈敏度。不幸的是，更長的反應時間通常會導致高背景信號，造成低訊噪比。HRP偶聯抗體在酶和抗體比活性兩方面，皆被認為優於AP偶聯抗體，這是由於HRP酶的尺寸較小，並且於高度相容於結合反應。此外，高活性率、良好的穩定性、低成本和廣泛的受質供應，使HRP成為大多數應用的第一首選用酶。

由於多種受質可供選擇，酶偶聯抗體為western blotting的檢測和記錄方法提供了最大的靈活性。最簡單的檢測/記錄系統是使用呈色受質。雖然不像其他受質那樣敏感，但呈色受質允許直接目視觀察訊號發展。不幸的是，當印漬乾燥或在儲存過程中，呈色受質往往會褪色，這使得印漬本身成為不可靠的記錄。然而，複印或直接對印漬進行掃描，以獲得western blot呈色結果的永久複本是相當直接簡單的。

化學發光印漬受質與其他受質的不同之處，在於信號是酶-受質反應的瞬態產物，只有在反應發生時持續存在。如果受質耗盡或酶失去活性，則反應將停止，並且失去信號。然而，透過適當的抗體稀釋和充足受質用量的優化檢測中，反應可產生1到24小時穩定的光源輸出（具體取決於受質），因此可利用X射線底片或數位成像設備完成穩定一致且靈敏的檢測紀錄。雖然X射線底片可以獲得半定量數據，但數位成像因其檢測動態範圍更廣而擁有更高的靈敏度，讓研究人員能夠從western blot中獲得定量的數據。

使用螢光團偶聯抗體的步驟更少，因為在分析過程無須受質開發步驟。雖然實驗流程較短，但由於需要激發光源，該方法需要特殊設備來檢測和記錄螢光訊號。數位成像的最新進展以及新一代螢光團（如紅外線、近紅外線和量子點）等開發，提高了使用螢光探針進行western blotting和其他免疫測定的靈敏度和普及性。儘管儀器設備和螢光團偶聯抗體可能相當昂貴，但這種方法具有多重兼容性的額外優勢（同一實驗中可使用一個以上的螢光團）。此外，與其他印漬程序相比，化學廢棄物也一併減量。

延伸閱讀：化學發光western blotting
探索： 檢測試劑
探索： Western Blot成像系統

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• 手冊：蛋白質凝膠電泳技術手冊
• 手冊：Western Blotting技術手冊
• 手冊：蛋白質研究
• 手冊：基於抗體的生物醫學研究工具
• 技術提示#24： Western blot抗原和抗體濃度的最佳化
• 技術提示 #59： 如何選擇二抗：片段特異性的指南
• 技術提示 #32： Western blotting酶受質選擇指南