什麼是HPLC？

HPLC是高效能液相層析法（High Performance Liquid Chromatography）的簡稱。它是定性和定量分析中最為常用的分析方法之一。

高效能液相層析法可以對含有多種溶質成分的樣本進行快速且同步的定性和定量分析。高精密度的儀器使分析值具有很高的再現度。此外，注入HPLC的樣本量可以從幾微升（μL）的量級開始測量。HPLC系統的配置以及參數可以按照分析者的目的進行選擇，因此適用於很多不同的樣本。正因為這些特點，奠定了它的科技地位，支撐著全世界所有科學領域和產業基礎。

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HPLC的原理與特點

在講解HPLC之前，我們先簡單回顧一下層析法。

層析法是由俄羅斯植物學家米哈爾・茨威特（Mikhail Tsvett）於1903年創立的一種物理分離物質的技術。基於兩相之間的分佈，層析法可將分離對象（分析種）有效率地分離。「兩相之間」聽起來可能會有點難懂的話，想像一下，水與油（如正己烷）兩種溶劑進行液-液分離操作。由於這兩種溶劑互不相溶，因此即使你試圖將它們混合，它們也會很快分離成兩相，亦即水相與油相。如果你加入另一種成分作為溶質，溶質將以何種相位存在？

例如，當加入糖這種易溶於水的溶質時，由於糖幾乎不溶於油相，所以更多存在水相之中。相反，當加入易溶於正己烷，如沙拉油這種溶質時，在油相中存在會比在水相中的多。可以看出，水和正己烷兩相中，糖與沙拉油的比例（即分配比）是很不一樣的。因此，如果想從等分試樣中只取出（分離）糖，可以只取出等分試樣的水相，讓水排掉，只得到糖。如果要提取出沙拉油，可以取出油相，進行同樣操作將其分離出來。

層析法也就是這個原理，可以利用兩相分配的差異，將分析物分離或純化。但是，層析法中的兩相，其中一相是固定的，另外一相則循特定方向移動。前者稱為「固定相」，後者則稱為「流動相」。在層析法中，固定相和流動相的組合使分析人員能夠控制分析物的分離狀況。因此，了解分析種、固定相以及流動相這三個特點對於層析法而言非常重要。

以液體作為流動相的層析法稱為液相層析法（Liquid Chromatography：LC），以氣體作為流動相的則稱曾為氣相層析法（Gas Chromatography：GC），根據分析物或樣本的種類，分析者的目的不同，而採用不同的層析法。氣相層析法主要針對具揮發性的分析物。

HPLC的優點

如上所述，高效能液相層析法HPLC是適用範圍非常廣泛的分析手法，根據儀器各部分的設置不同，得出的分析結果也會有很大差異。

HPLC具有以下優點：

  • 一次分析可以同時對多種分析物（溶質）進行定性與定量分析。
  • 分析的靈敏度範圍很廣，可因應裝置的組成以及分析條件的設定，從%到ppt量級皆可測出。
  • 目標分析物的分子量從低分子量（數克/摩爾）到高分子量（數千萬克/摩爾）不等。
  • 分析物是否可以分離，由「固定相」與「流動相」的組合決定（實際測試時，樣本通常夾雜目標分析物以外的成分，分析者需要考慮該樣本的最佳檢測方法，考慮層析管柱與流動相等條件組合將大大影響到分析的可行性。）
  • 分析結果具有較高的再現性。這對於特別是採用自動進樣器時，可以保證高再現度的同時，進一步提高生產效率。

可利用HPLC分析所測量的成分

HPLC分析可用於從低分子量到高分子量，離子型與非離子型等多種分析物。對於離子分析物，常利用離子層析法，這也是HPLC的一種。

各科學領域的一般目標化合物的例子如下：

製藥、醫藥、代謝物組學

低份子量藥物、原料藥、中間體、生物製藥（抗體藥物、核酸藥物、肽類藥物等），完整蛋白、聚集體、變形產物、糖鏈、糖胺聚糖、生物仿製藥、改良型生物藥品、PEG化蛋白、PEG化肽、糖肽、藥物代謝物、單株抗體、糖蛋白、生物標記物、亞磷酸、低聚糖、脂質、磷脂、脂肪酸。

食品、飲料

糖類（單糖、雙糖、低聚糖、多糖、糖醇）、維他命、抗生物質、動物用藥、殘留農藥、POPs、黴菌毒素、食品添加劑（色素、染料、人造甜味劑、防腐劑等）、香料、反式脂肪酸

水、土壤、大氣、環境

高爾夫球場農藥、除草劑、POPs、無機離子、無機酸、有機酸、鹵乙酸、醫藥品及個人護理產品（PPCP）、有機氟化物（PFCs）

法醫、毒物

受管制藥物（麻醉劑、合成麻醉劑、大麻、興奮劑、特制藥物、精神藥物、鴉片類藥物等、與反興奮劑有關的（禁藥、類固醇等）、藥物代謝物。

化學、工業

化妝品、化工產品、原料、反應中間物質、反應產物、合成產品、合成副產品、

HPLC 的配置

HPLC高效液相層析儀從流道上游開始由以下五段組成。可透過以下影片，了解儀器的配置以及作用。

①    泵・流動相

流動相由泵以恆定流速泵送。按照不同的裝置構成，可以在泵前與泵後混合多種流動相，在分析過程中改變流動相組成的分析方法稱為「梯度分析」或「梯度洗脫」。

②   樣本注入裝置

往HPLC注入目標測定樣本。主要以自動進樣器或手動注射器來完成。

③   層析管柱（固定相）

在HPLC中分離樣本的部分，是由不鏽鋼（或樹脂）管包裝的柱填料，擔當固定相的功用。在大部分情況下，填料會是硅膠或聚合物微粒，種類繁多，且其表面通常經過化學修飾。

④   檢測器

從層析管柱分離出的分離物質，透過檢測器被檢出的信號，以電子訊號傳送給數據處理部分，例如電腦。檢測器有很多類型：最常見的是作為光學檢測器的UVD、DAD、RID和FLD；或者以電作為檢測原理的Corona CAD、CDD和PAD等。此外質譜法也被廣泛應用。它可以根據分析種的質量電荷比（m/z）進行分離、定性和定量分析。根據其內部構造可以分為單四極、三段四極、Thermo Scientific™ Orbitrap™等類別。

⑤   數據處理

這是利用電腦以及數據分析軟體，對從檢測器接收到的信號進行分析及輸出的部分。分析人員可以將從HPLC分析得到的分離結果，以「層析圖」或光譜的形式進行確認。

HPLC的定性、定量分析

在HPLC中，根據層析圖中出現的峰值時間，以及其面積值，對分析物種作出定量與定性分析。

定性：分析物的滯留時間

定量：分析物的峰值大小（面積值、積分值）

這裡利用分析物種的特性實現分離。因此如果HPLC的分析條件（流動相、固定相、裝置條件、樣品等）保持不變，則某一分析中在層析圖中總會同一時間出現峰值。但是，有些樣品中含有與分析物種具相似化學性質的物質混合在內的話，往往在層析圖上不能充分分離。

在這種情況下，定性與定量分析就會變得很困難，所以需要通過適當改變HPLC分析條件，或者利用質譜儀等高分辨度的檢測器，優化測試結果。定量的話可利用分析物種峰值的面積值（= 檢測器的反應值）。分析者在分析目標分析物種前，幾種分析物種的標準溶液（已知濃度的樣本溶液），以樣本濃度得出的峰值面積值畫出「校準線」。根據該校準線，從實際樣品分析中得到的峰面積，計算出樣品中存在的量，以進行定量分析。

透過以下影片，了解從HPLC柱的分離和檢測過程。

HPLC的測定濃度範圍

HPLC的檢測濃度範圍很受檢測器影響。因應檢測器的檢測原理不同，對被分析物的反應的特異性及檢測器的動態範圍而不同。因此需要根據樣品的性質，被分析物的存在量，以及目標檢測範圍來選擇檢測器。為提高檢測器的響應程度，在進行HPLC分析前，將樣品預先處理也是常見方法，包括將分析物濃縮、稀釋及除去當中的雜質。

可測濃度範圍由層析管柱所決定。根據柱填料的類型，顆粒大小，柱徑大小，分離所要求的最佳樣品進樣量也有很大分別。為了得到理想的分析結果，對層析管柱的選擇應經慎重考慮。

適用於HPLC的樣本

HPLC主要用於液體樣本（溶液）的分析。固體樣品在進行HPLC分析之前需要預先處理。萃取、溶解和分解是將固體樣品轉化為溶液的常用方法。然而，最終的樣品溶液必須能夠溶於HPLC所用的流動相中，因此在預處理階段必須確認與流動相的混溶性。

HPLC測定時間

一般而言，分析時間從幾分鐘到一個小時都是很平常的。但是，根據分析者的目的，所需要的分析靈敏度，以及分析物種類的數量會有很大差異。最近，比HPLC更耐壓，性能更高的超高效能液相層析法（Ultra High Performance Liquid Chromatography：UHPLC）日漸普及，分析時間可縮短到幾分鐘以內。

結語

高效能液相層析法HPLC是一種分析方法，具有分析值準確，檢測靈敏度高，通用型強，通量大等諸多優點，也是支撐了各科學領域科學家的基礎技術。

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