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簡介

Invitrogen™ Lipofectamine™ 2000是一種專利配方，可將核酸（DNA和RNA）轉染到真核細胞中，具備以下優勢：

  • 在多種細胞類型和規格（如96孔盤）中具有最卓越的轉染效率。關於成功轉染的細胞類型列表，請參閱細胞株資料庫。
  • 核酸–Lipofectamine 2000複合體可以在含有或不含血清的情況下，直接添加到培養基的細胞中。
  • 轉染後無需去除複合體或更換/添加培養基，但複合體可在4-6小時後移除。

轉染指南

  • 參考第2頁步驟，使用短干擾RNA（siRNA）或Invitrogen™ Stealth RNAi™ 進行細胞轉染。
  • 參考第3頁步驟，使用質體DNA進行細胞轉染。我們建議使用Opti-MEM I減血清培養基（貨號31985-062），在複合體形成前對Lipofectamine 2000和核酸進行稀釋。
  • 轉染過程中請勿在培養基中添加抗生素，因為這會導致細胞死亡。在實驗之間請保持相同的seeding條件。
  • 測試無血清培養基與Lipofectamine 2000的相容性，因為一些無血清配方（如CD293、SFM II、VP-SFM）可能會抑制陽離子脂質體的轉染。

注意：如果您正在進行RNAi實驗，請參閱RNAi 成功的七個步驟以獲得更多的提示。此外，請觀看我們的RNAi實驗方案。

實驗方案―Stealth RNAi或siRNA轉染

運用這個簡短的實驗流程，將Stealth RNAi或siRNA轉染到24孔盤規格的哺乳動物細胞中。所有的數量和體積都是以每單一孔為基礎單位。將本流程作為一個起點；依照《Stealth RNAi或siRNA轉染優化》所述方式對轉染進行最佳化，特別是當您首次進行哺乳動物細胞株轉染。

  1. 轉染前一天，將細胞置於500 µl不含抗生素的生長培養基中，使其在轉染時達到30-50%的融合度。注意：在較低的密度下轉染細胞，可以延長轉染和檢測點之間的時間間隔，並盡量減少由於細胞過度生長而導致的細胞活性損失。

  2. 對於每個轉染樣品，依下列方式製備寡聚物-Lipofectamine 2000複合體：
    • A. 在不含血清的50 µl Gibco™ Opti-MEM™ I減血清培養基中，稀釋20 pmol的Stealth RNAi或siRNA寡聚物（oligomer）（Opti-MEM中RNA的最終濃度為400 nM）。輕輕攪拌均勻。
    • B. 使用前輕輕混合Lipofectamine 2000，然後將其1 µl稀釋在50 µl Opti-MEM I減血清培養基中。輕輕攪拌並在室溫下作用5分鐘。注意：在25分鐘內進行下一步。
    • C. 作用5分鐘後，將稀釋的寡聚物與稀釋的Lipofectamine 2000混合。輕輕攪拌並在室溫下作用20分鐘（溶液可能呈現混濁狀）。
  3. 將寡聚物-Lipofectamine 2000複合體添加到每個含有細胞和培養基的孔中。來回搖動孔盤以輕輕混合均勻。

將細胞放在37°C 的CO2培養箱中培養24-96小時，直到您準備好進行基因敲落（gene knockdown）分析。4-6小時後可更換培養基。

Stealth RNAi或siRNA轉染優化
為了獲得最高的轉染效率和低非特異性效應，可透過改變RNA和Lipofectamine 2000的濃度來優化轉染條件。以24孔盤規格，進行10-50 pmol RNA和0.5-1.5 µl Lipofectamine 2000的測試。根據目標基因的性質，在優化條件時也可以考慮以更高的密度來轉染細胞。

擴大或縮減轉染的規模

為了在不同的組織培養形式下轉染細胞，可根據相對表面積的比例改變Lipofectamine 2000、核酸、細胞和培養基的用量，如下表所示。對於使用96孔盤的自動化高通量系統，轉染的複合物體積建議使用量為50 µl。

注意：您可以透過直接將細胞接種到轉染混合物中，來進行快速96孔盤轉染。在孔盤中製備複合體，並在100 µl體積中以基本方案的兩倍細胞密度，直接進行細胞添加。在複合體存在的情況下，細胞會像往常一樣貼附。

培養容器
每孔的表面面積1
共用試劑
DNA轉染
RNAi轉染
接種培養基體積
稀釋培養基體積2
DNA
Lipofectamine 2000
RNA
Lipofectamine 2000
96-well
0.3 cm 2
100 µL
2 x 25 µL
0.2 µg
      0.5 µL
 5 pmol
    0.25 µL
24-well
2 cm 2
500 µL
2 x 50 µL
0.8 µg
      2.0 µL
 20 pmol
      1.0 µL
12-well
4 cm 2
1 mL
2 x 100 µL
1.6 µg
      4.0 µL
 40 pmol
      2.0 µl
6-well
10 cm 2
2 mL
2 x 250 µL
4.0 µg
      10 µL
100 pmol
        5 µL
60-mm
20 cm 2
5 mL
2 x 0.5 mL
8.0 µg
      20 µl
200 pmol
      10 µL
10-cm
60 cm 2
15 mL
2 x 1.5 mL
24 µg
      60 µL
600 pmol
      30 µL

1  表面積可能因製造商而有差異。
2  在DNA或RNAi轉染方案中，步驟2a和2b中稀釋培養基的體積。

LT080     11-Jul-2006