Ícone da Calculadora Tm

Esta ferramenta calcula o Tm de primers e estima uma temperatura de anelamento apropriada ao usar diferentes polimerases de DNA. Como usar esta calculadora

Encontre rapidamente a temperatura de anelamento certa para a polimerase de DNA Platinum SuperFi (também funciona para o Kit SuperScript IV One-Step RT-PCR), polimerases de DNA Phusion e Phire.

Nota importante: Se o primer de PCR contiver regiões não alvo desejadas (mismatches), por exemplo, para criar uma mutação ou um sítio de restrição, certifique-se de calcular a Tm somente para a sequência corretamente combinada

A calculadora T mnão é necessária para polimerase de DNA Platinum II Taq, polimerase de DNA Platinum SuperFi II, E Platinum Direct PCR Universal Master Mix e polimerase de DNA Phusion Plus devido a seus tampões especialmente formulados para uma temperatura universal de anelamento de 60 °C.

1. Selecione sua polimerase de DNA

Polimerase de DNA Platinum Super Fi
(Selecione também esta opção se estiver usando o kit SuperScript IV One-Step RT-PCR)
Polimerase de DNA Phusion ou Phire
Polimerase DreamTaq DNA ou outra polimerase de DNA baseada em Taq

2. Selecione o método de entrada

Par único
Lote

3. Digite ou cole sua sequência

4. Condições da PCR

µM
mM

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Como usar a calculadora Tm

A calculadora calcula a Tm recomendada (temperatura de melting) de primers e temperatura de anelamento de PCR com base na sequência do par de primer, concentração de primer e polimerase de DNA usada na PCR. A calculadora também calcula o comprimento do primer, a porcentagem do conteúdo de GC, o peso molecular e o coeficiente de extinção.

O método termodinâmico modificado de Allawi & SantaLucia [1] é usado para o cálculo da temperatura de Tm e anelamento das reações com as polimerases de DNA Platinum SuperFi, Phusion e Phire. Os parâmetros foram ajustados em um conjunto de primers que buscavam maximizar a especificidade e manter altos rendimentos.

Para usar esta calculadora, selecione sua polimerase de DNA, digite ou cole suas sequências de primer e forneça sua concentração final de primer. Os valores Tm, a temperatura de anelamento e outros dados são gerados automaticamente.

Se necessário, use um gradiente de temperatura para otimizar ainda mais e determinar empiricamente a temperatura ideal de anelamento para cada combinação de molde-primer. O gradiente de temperatura de anelamento deve começar com a temperatura de 6 a 10 °C inferior à temperatura de anelamento gerada pela calculadora, e aumentar até a temperatura de extensão (PCR de duas etapas).

  1. Allawi, H. T., and SantaLucia, J. (1997). Thermodynamics and NMR of internal G-T mismatches in DNA. Biochemistry, 36(34), 10581-10594.
     

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