Transferencia de métodos
Retardo de gradiente
Modos de calentamiento
Volúmenes adicionales
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La transferencia de métodos es la adaptación de un método de análisis a un sistema de HPLC diferente. Cuanto más similares sean los dos instrumentos, más sencillo será el proceso.

Entre los tipos más comunes de transferencia de métodos se incluye la conversión de métodos de HPLC a métodos de UHPLC con el fin de optimizar la velocidad y mejorar el procesamiento de muestras. En otros casos se transfiere un método validado de un laboratorio a otro, como de un laboratorio de investigación y desarrollo a un laboratorio clínico y de procedimientos.

Independientemente de la similitud entre los sistemas, las transferencias de un instrumento a otro suelen generar variabilidades debido a las diferencias en las tecnologías de hardware y software, en particular entre sistemas de diferentes fabricantes. 

Parámetros del hardware que afectan a la transferencia de métodos

Los parámetros como el volumen de retardo del gradiente, los tipos de bomba, los modos de calentamiento de columna, el volumen de celda de flujo del detector, los ajustes del detector y los volúmenes de columna adicionales afectan a la reproducibilidad de un método que se haya transferido. La mejor manera de superar las complicaciones derivadas de la transferencia de métodos y lograr resultados equivalentes con ambos instrumentos es considerar todos los parámetros de un sistema durante la transferencia.

Volumen de retardo del gradiente (GDV)    

El volumen de retardo del gradiente es el volumen desde el punto en el que se mezclan los eluyentes hasta la cabeza de la columna.

  • El instrumento de GDV desempeña un papel central en la transferencia con éxito de métodos de HPLC o UHPLC. Más información ›
  • Las modificaciones del GDV entre instrumentos pueden alterar la resolución y el tiempo de retención, por lo que cambiar el GDV es una solución estándar durante la transferencia de métodos. Más información ›

Dado que el GDV varía en todos los instrumentos, no siempre es fácil igualar la diferencia de volúmenes.

Factores que afectan al volumen de retardo del gradiente

El GDV se ve afectado por todos los volúmenes entre el punto de la mezcla de la fase móvil y la cabeza de la columna, pero normalmente es la bomba la que más afecta al GDV. Además de los volúmenes de la mezcla, también es esencial el tipo de bomba, ya que las bombas de mezcla a baja presión muestran GDV significativamente más altos que las bombas de mezcla a alta presión.

Los efectos de mezcla del volumen de la muestra y la fase móvil circundante también son relevantes para la reconstrucción de la forma de pico en el nuevo sistema. Una dimensión pequeña de los tubos ayuda a reducir la dispersión de picos delante y detrás de la columna. Los volúmenes más grandes mejoran la mezcla precolumna del tapón de la muestra, lo que afecta de forma positiva a los picos de elución especialmente tempranos si el disolvente de la muestra tiene una alta fuerza de elución.

Durante la transferencia entre métodos también hay que tener en cuenta los volúmenes de las celdas de flujo del detector, ya que todos los volúmenes influyen en la dispersión de los picos antes de la detección. El volumen de las celdas de flujo debe ser pequeño en comparación con el volumen pico, y los ajustes del detector deben ser uniformes y capaces de proyectar la forma adecuada.    

Efecto de los modos de calentamiento

La función de la termostatización o el calentamiento de la columna y la fase móvil durante la transferencia de métodos no se le da la importancia necesaria.

Los diferentes modos de calentamiento de columna (p. ej., por aire estancado y por circulación forzada de aire) junto con el calentamiento precolumna afectan de distintas formas a la selectividad de la separación debido a los gradientes de temperatura radial o axial. Este efecto aparece especialmente en separaciones a presiones superiores a 400 bares, donde se produce el calentamiento friccional del material de la columna.

Efectos adicionales de los volúmenes de columna

Si se garantiza que el volumen de columna adicional (ECV) del nuevo instrumento coincide con el del sistema original, se podrán transferir los métodos correctamente sin tener que repetir la validación.

El volumen precolumna amplía el tapón de la muestra y suaviza el gradiente. El volumen poscolumna solo afecta a la ampliación de la banda de analitos. Los volúmenes precolumna y poscolumna afectan a los tiempos de retención de los analitos.

En particular, hay mayor variabilidad de datos en los métodos de UHPLC que en los de HPLC. Asegúrese de tener en cuenta la variación de ECV durante la transferencia de métodos, especialmente al transferir un método establecido entre diferentes fabricantes y modelos de sistemas. 

No se debe ignorar la complejidad y la probabilidad de encontrarse con algunos problemas durante la transferencia de métodos, como la reproducibilidad del tiempo de retención. Para evitar contratiempos en el proceso, analice cuidadosamente los parámetros del método, las características del sistema y la compatibilidad. A continuación se comparten algunos recursos de la comunidad experta que le ayudarán a prepararse para la transferencia de métodos y a solucionar cualquier problema.

La transferencia de métodos de HPLC o UHPLC de un instrumento a otro no tiene por qué ser estresante. En este vídeo se comparten consejos de la comunidad experta y prácticas recomendadas que puede utilizar para que la transferencia del método de LC sea un proceso sencillo.

 
 
 
Preguntas frecuentes

¿Qué es la transferencia de métodos en la HPLC?

La transferencia de métodos es la adaptación de un método de análisis a un sistema de LC diferente. Entre las situaciones más comunes se incluye la conversión de métodos de HPLC a métodos de UHPLC con el fin de optimizar la velocidad y mejorar el procesamiento de muestras. Otra situación es la transferencia de un método validado de I+D a un laboratorio clínico o de procedimientos.  

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