Funcionamiento de los detectores para HPLC

Funcionamiento de los detectores de longitud de onda variable

Un detector de longitud de onda variable utiliza una rejilla giratoria para dispersar la luz policromática en el espectro. A continuación se selecciona la luz de una sola longitud de onda. La luz pasa entonces a través de la ranura de salida.

Una vez que la luz ha pasado por la ranura de salida, un divisor de haz o un espejo semipermeable divide el haz en dos partes. Una parte de la luz pasa a un diodo de referencia para medir la intensidad sin absorción. La segunda parte pasa a través de la celda de flujo, donde la muestra absorbe la luz de forma parcial. La intensidad de la luz restante se mide mediante el fotodiodo de detección y se transforma en una señal cuantitativa.

Al seleccionar una longitud de onda antes de la exposición de la muestra, se utiliza la luz de una longitud de onda para medir la absorción. Este método de detección ofrece una alta sensibilidad debido a la medición simultánea de una referencia real, además de reducir la exposición total a la luz de la muestra durante la detección.

La sensibilidad mejorada de los VWD frente a los DAD es esencial para los compuestos sensibles a la luz.    

Funcionamiento de los detectores de matriz de diodos y de longitud de onda múltiple

Los detectores de matriz de diodos y los de longitud de onda múltiple utilizan una rejilla para dispersar la luz en una matriz de fotodiodos una vez que la luz ha atravesado la celda de flujo. Como resultado, todas las longitudes de onda se absorben simultáneamente, lo que proporciona al analito un espectro de absorción completo.

Este método de detección se recomienda para analizar mezclas complejas o muestras de composición desconocida como, por ejemplo, durante el desarrollo de métodos o el análisis de pureza del pico.  

Funcionamiento de la FLD

Los detectores de fluorescencia miden los fotones emitidos por moléculas fluorescentes tras la excitación a una longitud de onda determinada.

Hay una relajación vibracional antes de la emisión de un fotón durante la relajación electrónica. Esta relajación vibracional conduce al desplazamiento al rojo de los fotones emitidos frente a los fotones de excitación, lo que se denomina desplazamiento de Stokes.

Simplificando, las moléculas fluorescentes pierden la energía restante al emitir más luz que la longitud de onda de absorción original. 

Funcionamiento de la RID

Un índice de refracción es un número adimensional que describe la rapidez con la que la luz se propaga a través de un medio en comparación con el vacío. La ley de Snell determina la refracción de la luz a medida que atraviesa el borde de separación entre dos medios con diferentes índices de refracción.

El tipo de detector de índice de refracción más común es el de desviación. En este tipo de detectores, la celda de flujo tiene una trayectoria de flujo de celda de muestra y una trayectoria de flujo de celda de referencia que se comparan con la fase móvil.

Cuando el analito pasa a través de la celda de flujo de la muestra, el índice de refracción y la dirección de la luz dentro de la celda de flujo cambian en proporción a la concentración del analito. Como consecuencia, se aplica un cambio en la dirección de la intensidad de la luz para determinar la concentración cuando se calibra el sistema para una combinación determinada de analito y fase móvil.

Funcionamiento de la CAD

En la CAD, los analitos se detectan como un aerosol cargado positivamente y la carga total se mide como una corriente de forma independiente de las propiedades ópticas. El tamaño de la carga depende del tamaño de la partícula, por lo que una mayor masa producirá una partícula más grande y con más carga. Una partícula grande da como resultado una mayor respuesta de la señal.

Todos los detectores de aerosoles cargados utilizan la tecnología de evaporación. La conversión de los analitos a señales que se puedan detectar implica los mismos pasos que se indican a continuación:

1. Nebulización mediante formación de gotas a partir del flujo del eluyente

2. Acondicionamiento mediante la selección de gotas de un intervalo de tamaños determinado

3. Evaporación con la conversión de gotas para formar partículas de aerosol residuales y no cargadas que estén compuestas de analitos no volátiles

4. Transferencia de la carga positiva del gas ionizado a las partículas de aerosol evaporadas

5. Cuantificación de las partículas de aerosol cargadas mediante un electrómetro

Tanto en la CAD como en la ELSD se utilizan detectores de aerosoles no lineales y evaporativos capaces de detectar compuestos no volátiles y muchos compuestos semivolátiles. Pero la diferencia entre las dos tecnologías es la forma en que se detectan las partículas.

En la CAD se mide la carga de partículas mientras que en la ELSD se mide la capacidad de la partícula para dispersar la luz.  Esta diferencia afecta significativamente a la eficacia del detector.

La ELSD también es menos sensible que la CAD, tiene un rango dinámico lineal más estrecho y produce curvas de calibración complejas debidas a la dispersión de la luz.

Además, la respuesta interanalito en la ELSD puede variar debido a las propiedades ópticas de la partícula (por ejemplo, al índice de refracción, a la absorción o a la fluorescencia), lo que puede alterar la sensibilidad del detector.

Los espectrómetros de masas tienen tres componentes principales: la fuente de iones, el analizador de masas y el detector, en ocasiones denominado «electrómetro». En la MS, los analitos se transfieren a la fase gaseosa, se cargan, filtran y detectan en función de la relación masa-carga (m/z). 

En primer lugar, la fuente iónica genera iones de fase gaseosa desde el flujo del eluyente y proporciona un haz de iones focalizado al analizador de masas. A continuación, el analizador de masas separa los iones en el tiempo o espacio en función de la respectiva relación m/z. Por último, el detector convierte los iones en una señal eléctrica basada en el tiempo y ofrece un espectro con la relación m/z seleccionada dentro del intervalo del barrido.

La diferencia clave de un espectrómetro de masas a otro es su analizador de masas. Algunos ejemplos son los espectrómetros de trampa iónica, de cuadrupolo, con tecnología de tiempo de vuelo u orbitrap, que cuentan con diferentes analizadores que ofrecen distintas ventajas en cuanto a resolución, velocidad y sensibilidad.

La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) implica el uso de varias fases de análisis de masas para obtener más información de las estructuras y/o mayor especificidad que con la MS de una sola fase. En la primera fase, los iones precursores se aíslan en función de la relación m/z. A continuación, se fragmentan los iones seleccionados, normalmente mediante aceleración a través de un gas inerte. Por último, los iones fragmentados se aíslan y se detectan.  

Explore nuestro centro de aprendizaje de MS para obtener más información sobre las ventajas de la detección de masas.