用于体积电子显微镜检查的连续切面成像

在自然背景下揭示细胞和组织的复杂 3D 结构对研究生物系统的结构-功能关系至关重要。近年来，基于 SEM 的大体积组织 3D 重建方法取得了很大进展。连续切面 SEM (SBF-SEM) 在 SEM 真空腔室内对塑料包埋组织块进行原位切片和成像，可实现大体积组织全自动重建。目前为止，轴向分辨率受限于可以从切面上切割的最小截面厚度；但结合 SBF-SEM 和多能量去卷积 SEM (MED-SEM)，Thermo Scientific Volumescope 2 SEM 目前能够实现具有真正各向同性 3D 分辨率的大体积成像。

在连续切面成像过程中，电子束首先用于扫描树脂包埋组织样本的表面，捕获样本的 2D 图像。

随后用原位切片机切除该顶部表面。每个切片的厚度由用户定义，但通常大于 15-20 µm。丢弃后，该切片可被碎屑收集装置收集。

然后通过 SEM 采集新表面的图像。重复该过程，直至完成整个样本成像；总样本高度范围为数十至数百微米或以上。然后使用 3D 渲染软件处理连续图像堆栈。

可优化并细化连续切面成像过程，以匹配特定用户或样本需求和要求，包括局部感兴趣区域、多个区域或多种成像探测器。

多能量去卷积 SEM (MED-SEM) 是一种将机械切片与光学切片相结合以提高轴向分辨率的新方法。通过使用金刚石刀对切面进行原位切片后，可不断增加加速电压对新鲜暴露组织多次成像。这些图像随后会用于去卷积算法，以得到多个光学亚表层，形成 3D 子集。通过重复这种循环，Volumescope 2 SEM 可提供具有 10 nm z 轴分辨率的各向同性数据集。

使用可视化软件 Thermo Scientific Amira 的标准化方案，以 3D 形式定量细胞器形态，从而准确且可重现地测量这些细胞的亚结构。使用 SBF-SEM 和 Amira 软件方案定量线粒体和内质网 (ER) 结构。

“我过去常浏览网页。而现在我浏览数据集。结构就是功能，这是细胞生物学的信条。”

梅奥诊所的 Jeffrey Salisbury 教授谈论了他超过 45 年的显微镜检查经验，回答了多种生物学问题，包括最近的 3D 研究，通过连续切面成像来观察正常和病变状态下组织、肾脏和大脑的多种样本的 3D 结构。

“真是令人无比激动，我们终于有机会开展一些真正的细胞生物学工作，这些年来，我一直在等待，现在我迫不及待地想要开始。”

Purdue 电子显微镜中心主任 Christopher Gilpin 谈论了连续切面成像及其在 3D 成像技术背景下用于生物多尺度绘图的潜在用途。