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自从2015年国家食药总局开展仿制药一致性评价工作以来，各制药企业都在积极认真的推进相关工作，按照要求第一批2018年底前须完成仿制药一致性评价品种289个，其中涉及国内批准文号17740个，国内制药企业1817 个（占比约40%，按 4800 家制药企业计算）；涉及进口批准文号104个，进口企业42家；17个品种（占比5.8%）批准文号在 400 个以上，45个品种（占比16%）批准文号过百，而批文数在3个及以下的药品仅占20%。

药物中的杂质是指除药物化学体以外的任何成分，是反映药品质量和安全性的重要指标。关于药物杂质的研究主要是聚焦在分离、鉴别和定量的工作上。在制药工业中主要使用液相色谱对有机杂质进行鉴别和定量。ICH规定对药物中大于0.1%的杂质应进行定性。

传统对杂质的定性方法需要将杂质分离制备，得到纯品后通过NMR、IR及MS等手段对其结构进行鉴别，其缺点一是周期长，分离制备成本较高；二是对于一些含量较少且不稳定杂质难于制备。

近年来随着LC-MS技术快速发展，已广泛应用于药物发现和开发的各个阶段。根据杂质的来源，产生条件，推测药物中可能含有的杂质，应用LC-MS技术，结合药物母核的质谱裂解规律和杂质的产生原理推断杂质的结构，已成为一种杂质研究的新理念。

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采用 DGLC 双三元液相，一维采用不挥发盐作为流动相添加剂以重现标准方法的分离与保留，二维进行杂质捕获和除盐。使用 DAD 二极管阵列检测器对一维和二维组分进行比对检测， Q Exactive对除盐后杂质进行高分辨质谱分析。双三元液相与高分辨质谱联用，实现了杂质有效的分离和鉴定。

液相色谱条件

仪器：Thermo Fisher UltiMate 3000 DGLC 双三元高效液相色谱仪

梯度条件

质谱条件

仪器：Thermo Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱

HESI离子源参数：Spray Voltage +3.5 KV/-2.8 KV，正负离子模式；Sheath Gas Pressure：40 arb；Aux Gas Pressure：10 arb；Capillary Temp：300 ℃；Heater Temp：350 ℃

质谱扫描参数：全扫描范围 120-1500 m/z，分辨率 140,000 FWHM；二级：数据依赖自动触发；母离子隔离窗口1.5 amu；分辨率 17,500 FWHM

结构解析软件将调用碎裂数据库（Fragmentation Library）快速的对 API 的碎片结构进行归属，该数据库几乎涵盖了所有已发表的文献，保证了碎片解析的准确性。在获得差异杂质质谱信息后，对不同组分之间的二级质谱进行比对，进一步对杂质变化位点进行推测。

Q Exactive 具有快速、高效的正负切换能力，能够实现一针进样即获得正离子和负离子下的一级和二级信息。通过正离子二级质谱（图4A）比对可知，m/z 298 部分碎片杂质 1 与 API 结构相同，通过负离子二级质谱（下图4B）比对可知，杂质与 API 结构差异部分存在于 m/z 196 的碎片。通过Q Exactive二级快速正负切换，获得API与杂质不同官能团碎片信息，有效锁定了置换位点（图5）。



图4  正离子（4A）和负离子（4B）二级质谱比对



图5 二级质谱碎片归属比对结果

总结

1、采用双三元液相色谱（DGLC）的在线除盐技术，实现了非挥发性流动相与质谱的兼容，达到了杂质有效分离和保留时间重现的目的。

2、利用高分辨质谱 Q Exactive对除盐后杂质进行检测分析，结合精确质量数、超高分辨率下的细分同位素、二级高分辨数据准确生成未知杂质的元素组成

3、通过 Q Exactive 独有的快速正负切换能力，对杂质与 API 的二级质谱进行比对分析，进一步确定了未知杂质的结构。该方法自动化程度高，鉴定准确性强，能够广泛的试用于药物杂质分析中。

4、利用DGLC-MS/MS流动相在线除盐技术，成功开发了阿莫西林、头孢地尼等药品的杂质鉴定方法，为客户的一致性评价提供了强有力的技术支撑。