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mRNA疫苗打破了传统灭活、减毒疫苗的免疫激活模式,创新性地利用人体本身细胞生产抗原,以此激活特异性免疫。mRNA疫苗的保护率极高,能达到90%。在研发上,mRNA疫苗能够快速地更新迭代以应对不断出现的变异毒株,且生产过程短,只需要60-70天。对于新型冠状病毒疫苗的研制,除了抗原设计外,选择合适的载体也是至关重要的。在疫情影响下,mRNA 疫苗让科研人员愈发重视,关于它的各项研究正在如火如荼地进行中。
通过工艺开发和质量控制对产品进行描述:为了使疫苗能被监管机构接受,需要对纯度/杂质监测(CQAs)进行深入的分析表征和确定的标准,以确保安全性和有效性。这意味着杂质需要通过表征来理解,定义可接受的水平,然后监测安全性和有效性。
目前获批上市的疫苗佐剂多数集中在微小颗粒或纳米颗粒,包括铝盐、乳剂、脂质体和病毒载体。
脂质体主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构,可包裹多种疫苗,并有效地将抗原送至细胞对应靶点。其作用机制与铝佐剂相似,具有储存库效应,并可以增强抗原递呈细胞(APC)对抗原的摄入。
由上述介绍可以看出,大部分佐剂都没有紫外吸收,CAD电雾式检测器较传统紫外检测器、ELSD检测器等有着独特的优势,分析物既不需要发色团也不需要离子化,适用于不挥发及半挥发化合物的高灵敏度检测。
CAD检测器有更高的灵敏度、更宽的线性范围、更好的重现性成为新冠mRNA疫苗质量控制的首选。本实验利用Vanquish Flex液相色谱系统和Charged Aerosol Detector H电雾式检测器来分析疫苗中的佐剂。
色谱图:
系统适用性色谱图
实验结果与讨论:
PEG(聚乙二醇)、Chol(胆固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)以及两种自制佐剂在0.25 µg/ml~50 µg/ml范围内线性良好,相关系数R2 >0.999。 本方法五种组分检测限为0.125 ppm(S/N=3),定量限为0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色谱图
由实验结果可知,本方法利用CAD电雾式检测器直接检测疫苗中的脂质体载体,无需进行前处理,灵敏度高,分离度和重复性好。
样品前处理简单,样品经纯化水稀释后可直接进样分析。
制剂样品色谱图
Nuclease T1是一种真菌核酸内切酶,可切割鸟嘌呤残基后的单链RNA,具有较强的特异性,常用于核酸测序应用。但由于核酸内切酶效率很高,酶解时间较难控制,且传统的溶液酶解方法会使核酸酶残留在分析柱上造成污染。基于以上需求,赛默飞推出了一款前处理磁珠,将Nuclease T1酶固定在磁珠上,通过简单快速的磁铁吸附及可有效控制酶解时间,并去除溶液里的T1酶,该方式可以有效提高实验的重现性并降低酶的干扰(如下图)。
有离线及在线两种方式可供选择:a) 将样品配成200 μL体积放于eppendorf管中(如下图a所示),置于酶解仪中震荡孵育(37-50℃, 2000 rmp)5min ,通过磁铁吸附的方式将酶解上清与磁珠分离,再加入1%甲酸终止反应;b) 采用全自动磁珠纯化仪,反应、分离及纯化均可根据设置好的程序进行自动操作,适用于高通量前处理需求(图b)。
图a:手动前处理示意图
图b: 全自动化在线前处理示意图
反应条件的优化:
a. 反应时间:酶解时间控制在5min 内,随着反应时间的增加(30min, 1h, 4h, overnight),序列覆盖度明显降低。对于修饰mRNA(如甲基化修饰),需要增加反应时间至30min.
b. 反应温度:37℃与50℃的结果类似
色谱分离采用一款专用于核酸分析的色谱柱,Thermo Scientific™ DNAPac™ RP,该色谱柱由球形宽孔径 4 µm 聚合树脂构成,可耐受极端 pH (0-14) 和温度 (5-110°C) 条件,在HPLC 和UHPLC仪器上均可使用,针对寡核苷酸可实现高分辨率和高通量,较小和极大的核酸链均可分辨(如下图A)。图B显示DNAPac™ RP色谱柱的各类型号,mRNA mapping建议选用2.1*100 mm型号。
图 A
图 B
核酸样品吸附性强,而生物惰性液相系统吸附低;其次离子对试剂易腐蚀液相系统管路及接口,因此建议使用生物兼容的Vanquish UHPLC系统。
液相方法如下图:
新一代Orbitrap Exploris系列产品具有体积小、性能高、操作简单等优势,扩展了Q Exactive系列质谱仪器的分析能力。如下图a所示,内置的AcquireX数据采集工作流程,为各种不同类型的应用设置参数模板,一键调用,可进行全面自动化的样品分析;且带有EASY IC离子源内标校正,保证仪器的高质量精度;更快的扫描模式可提高样品分析通量。图b显示mRNA mapping的方法模板:在peptide mode模式下,一级采用120,000分辨率,二级30,000分辨率;负离子扫描模式;stepped NCE 25,28,31 (优化后的能量,适用于mRNA mapping). 该方法模板可一键调用,操作简便,且得到高质量的谱图。
Biopharma Finder软件可实现核酸样品自动化数据分析,如下图a所示,软件支持DNA及RNA样品序列管理,可自定义核酸骨架和可变修饰,操作简便;对二级谱图进行自动化注释和解析;寡核苷酸杂质定性和相对定量分析;多批次样品含量变化趋势比对。图b 展示定结果图表,列表里的每一行代表一条鉴定的核酸链,右上方对应的理论及实测二级图谱,将图谱里响应很低的峰放大,可以清楚的看到碎片离子的同位素峰,结果可信度高。
图 a
图 b
Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基础上增加了长链mRNA mapping的功能,在数据处理方法中增加核酸酶模块,有常见的几种酶供选择,也可自定义添加酶。下图展示mapping分析结果,对于mRNA样品中每一条确证序列的片段,均可溯源详细信息,如在序列中的位置、一级和二级谱图、可信度、定量信息等。对于长度3900nt的mRNA样品,在该分析流程下,仅用RNAse T1酶解,即可获得98.5%序列覆盖度结果。
得益于Orbitrap仪器采集的高质量图谱,在核酸分析结果里几乎每一条链都可实现100%序列覆盖(Average Structural Resolution=1.0),这对于区分同分异构体非常有帮助。前面我们提到mRNA由4个特定碱基构成,在其酶解片段中出现同分异构是常见的现象,如下图,当仪器检测到足够多的碎片离子,可以确证同分异构的两条链里的每一个碱基,即可轻松区分两条分子量相同,序列不同的片段。
对于长链RNA片段,如下图具有13个漏切位点,48个碱基长度的片段,也可鉴定到每一个碱基,得到高可信度结果。酶解片段越长,其序列特异性越强,对于RNaes T1酶解无法覆盖的短片段,也可采用mazF酶解得到的更长片段作为互补信息。
编码新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)样品分析,首先用反相离子对色谱检测mRNA样品纯度,如下图a所示。采用上述mRNA mapping分析平台,从前处理到液质表征分析,得到如下结果:图b显示mRNA样品经过RNase T1酶解后的总离子流图,由于部分酶解,得到的片段较长,具有高特异性;与理论碱基序列匹配,在严格的数据筛选条件下,可得到98.5%的序列覆盖度。
图 a
图 b: Spike Protein mRNA digested with T1
图 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨质谱核酸分析平台,可以实现mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、杂质鉴定及定量等功能,为疫苗开发和质控提供更精确可靠的数据。
参考文献:
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500−8506 (2019)
目前获批上市的疫苗佐剂多数集中在微小颗粒或纳米颗粒,包括铝盐、乳剂、脂质体和病毒载体。
脂质体主要由磷酸类脂、胆固醇、硬脂胺等组成的单层或多层双分子夹水结构,可包裹多种疫苗,并有效地将抗原送至细胞对应靶点。其作用机制与铝佐剂相似,具有储存库效应,并可以增强抗原递呈细胞(APC)对抗原的摄入。
由上述介绍可以看出,大部分佐剂都没有紫外吸收,CAD电雾式检测器较传统紫外检测器、ELSD检测器等有着独特的优势,分析物既不需要发色团也不需要离子化,适用于不挥发及半挥发化合物的高灵敏度检测。
CAD检测器有更高的灵敏度、更宽的线性范围、更好的重现性成为新冠mRNA疫苗质量控制的首选。本实验利用Vanquish Flex液相色谱系统和Charged Aerosol Detector H电雾式检测器来分析疫苗中的佐剂。
色谱图:
系统适用性色谱图
实验结果与讨论:
PEG(聚乙二醇)、Chol(胆固醇)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰胆碱)以及两种自制佐剂在0.25 µg/ml~50 µg/ml范围内线性良好,相关系数R2 >0.999。 本方法五种组分检测限为0.125 ppm(S/N=3),定量限为0.25 ppm(S/N=10)。
定量限色谱图
由实验结果可知,本方法利用CAD电雾式检测器直接检测疫苗中的脂质体载体,无需进行前处理,灵敏度高,分离度和重复性好。
样品前处理简单,样品经纯化水稀释后可直接进样分析。
制剂样品色谱图
Nuclease T1是一种真菌核酸内切酶,可切割鸟嘌呤残基后的单链RNA,具有较强的特异性,常用于核酸测序应用。但由于核酸内切酶效率很高,酶解时间较难控制,且传统的溶液酶解方法会使核酸酶残留在分析柱上造成污染。基于以上需求,赛默飞推出了一款前处理磁珠,将Nuclease T1酶固定在磁珠上,通过简单快速的磁铁吸附及可有效控制酶解时间,并去除溶液里的T1酶,该方式可以有效提高实验的重现性并降低酶的干扰(如下图)。
有离线及在线两种方式可供选择:a) 将样品配成200 μL体积放于eppendorf管中(如下图a所示),置于酶解仪中震荡孵育(37-50℃, 2000 rmp)5min ,通过磁铁吸附的方式将酶解上清与磁珠分离,再加入1%甲酸终止反应;b) 采用全自动磁珠纯化仪,反应、分离及纯化均可根据设置好的程序进行自动操作,适用于高通量前处理需求(图b)。
图a:手动前处理示意图
图b: 全自动化在线前处理示意图
反应条件的优化:
a. 反应时间:酶解时间控制在5min 内,随着反应时间的增加(30min, 1h, 4h, overnight),序列覆盖度明显降低。对于修饰mRNA(如甲基化修饰),需要增加反应时间至30min.
b. 反应温度:37℃与50℃的结果类似
色谱分离采用一款专用于核酸分析的色谱柱,Thermo Scientific™ DNAPac™ RP,该色谱柱由球形宽孔径 4 µm 聚合树脂构成,可耐受极端 pH (0-14) 和温度 (5-110°C) 条件,在HPLC 和UHPLC仪器上均可使用,针对寡核苷酸可实现高分辨率和高通量,较小和极大的核酸链均可分辨(如下图A)。图B显示DNAPac™ RP色谱柱的各类型号,mRNA mapping建议选用2.1*100 mm型号。
图 A
图 B
核酸样品吸附性强,而生物惰性液相系统吸附低;其次离子对试剂易腐蚀液相系统管路及接口,因此建议使用生物兼容的Vanquish UHPLC系统。
液相方法如下图:
新一代Orbitrap Exploris系列产品具有体积小、性能高、操作简单等优势,扩展了Q Exactive系列质谱仪器的分析能力。如下图a所示,内置的AcquireX数据采集工作流程,为各种不同类型的应用设置参数模板,一键调用,可进行全面自动化的样品分析;且带有EASY IC离子源内标校正,保证仪器的高质量精度;更快的扫描模式可提高样品分析通量。图b显示mRNA mapping的方法模板:在peptide mode模式下,一级采用120,000分辨率,二级30,000分辨率;负离子扫描模式;stepped NCE 25,28,31 (优化后的能量,适用于mRNA mapping). 该方法模板可一键调用,操作简便,且得到高质量的谱图。
Biopharma Finder软件可实现核酸样品自动化数据分析,如下图a所示,软件支持DNA及RNA样品序列管理,可自定义核酸骨架和可变修饰,操作简便;对二级谱图进行自动化注释和解析;寡核苷酸杂质定性和相对定量分析;多批次样品含量变化趋势比对。图b 展示定结果图表,列表里的每一行代表一条鉴定的核酸链,右上方对应的理论及实测二级图谱,将图谱里响应很低的峰放大,可以清楚的看到碎片离子的同位素峰,结果可信度高。
图 a
图 b
Biopharma Finder 4.1版本在寡核苷酸分析的基础上增加了长链mRNA mapping的功能,在数据处理方法中增加核酸酶模块,有常见的几种酶供选择,也可自定义添加酶。下图展示mapping分析结果,对于mRNA样品中每一条确证序列的片段,均可溯源详细信息,如在序列中的位置、一级和二级谱图、可信度、定量信息等。对于长度3900nt的mRNA样品,在该分析流程下,仅用RNAse T1酶解,即可获得98.5%序列覆盖度结果。
得益于Orbitrap仪器采集的高质量图谱,在核酸分析结果里几乎每一条链都可实现100%序列覆盖(Average Structural Resolution=1.0),这对于区分同分异构体非常有帮助。前面我们提到mRNA由4个特定碱基构成,在其酶解片段中出现同分异构是常见的现象,如下图,当仪器检测到足够多的碎片离子,可以确证同分异构的两条链里的每一个碱基,即可轻松区分两条分子量相同,序列不同的片段。
对于长链RNA片段,如下图具有13个漏切位点,48个碱基长度的片段,也可鉴定到每一个碱基,得到高可信度结果。酶解片段越长,其序列特异性越强,对于RNaes T1酶解无法覆盖的短片段,也可采用mazF酶解得到的更长片段作为互补信息。
编码新冠突刺蛋白的mRNA (3900nt)样品分析,首先用反相离子对色谱检测mRNA样品纯度,如下图a所示。采用上述mRNA mapping分析平台,从前处理到液质表征分析,得到如下结果:图b显示mRNA样品经过RNase T1酶解后的总离子流图,由于部分酶解,得到的片段较长,具有高特异性;与理论碱基序列匹配,在严格的数据筛选条件下,可得到98.5%的序列覆盖度。
图 a
图 b: Spike Protein mRNA digested with T1
图 c: Sequence Coverage of Spike Protein mRNA
基于Orbitrap高分辨质谱核酸分析平台,可以实现mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、杂质鉴定及定量等功能,为疫苗开发和质控提供更精确可靠的数据。
参考文献:
[1] Jackson, N. et al. The promise of mRNA vaccines: a biotech and industrial perspective. Vaccines 11, (2020)
[2] Jiang, T. et al. Oligonucleotide Sequence Mapping of Large Therapeutic mRNAs via Parallel Ribonuclease Digestions and LC-MS/MS. Anal. Chem. 91, 8500−8506 (2019)