您的同行们在“使用 TAL 技术对帕金森病患者的 iPSC 进行基因组编辑：设计、检测和定量分析”网络讲座上提出了一些引人深思的问题，我们在此对这些问题进行汇总和解答。

 
您可以点击感兴趣的问题，快速查找答案。

问：效率为何如此之低？如何才能提高效率？

问：你们是否已经开始使用编辑后的 iPSC 细胞进行体内模型研究？

问：你们稍后是否会在网站上提供讲座的幻灯片？

问：你们使用何种抗体进行 a-syn 蛋白质印迹？

问：哪些脱靶类型发生变化？你们如何检查？

问：选择外显子 2（在 SNCA 基因中）进行切割的原因是什么？

问：是否可以在不使用 iPSC 的情况下进行此校正，例如使用 PD 患者的神经元？

问：我在分离单个 iPS 细胞时遇到问题。你们在实验中是否也存在这个问题？

问：是否可以使用复制缺陷型慢病毒来传递 TAL 质粒？这样能否提高效率？

问：GBA 突变是否与其他神经疾病存在关联？

问：合成 TAL 需要多长时间？

问：为了转化为目标生物体，是否必须在载体中构建 TAL？需要使用哪种载体？

问：你们是否在 TALEN 或供体模板中使用了选择盒？

问：你们是使用质粒供体模板还是寡核苷酸模板？

问：你们的供体模板上是否有筛选组织盒？

问：在 SNCA -/- 上，你们认为为何仍存在正确大小的蛋白质？也许是混合细胞群，而非克隆。

问：你们是否能够确认 iPSC 中不存在仙台病毒序列？

问：你们是否遇到过“主力”细胞系与实际使用的细胞系之间存在 TAL 活性差异？

问：你们是否仅在单个克隆上测试了 TaqMan SNP 测定？该测定是否适合将一个孔中的所有细胞用于进行 TAL 功能初步验证，或者是否存在背景干扰过高的问题？

 

问：效率为何如此之低？如何才能提高效率？

答：效率与采用相同技术的文献中报告的效率相同。有多种方法可以提高效率，例如，添加抗生素选择和/或 FACS 分选以富集转染细胞。

问：你们是否已经开始使用编辑后的 iPSC 细胞进行体内模型研究？

答：否

问：你们稍后是否会在网站上提供讲座的幻灯片？

答：是。此网络讲座可点播

 

问：你们使用何种抗体进行 a-syn 蛋白质印迹？

答：对于检测 a-Syn 蛋白的蛋白质印迹，我们使用了 Life Technologies 的小鼠 Synuclein Alpha 单克隆抗体（克隆 Syn 211），货号 AHB0261


问：哪些脱靶类型发生变化？你们如何检查？

答：我们正在探索脱靶事件。

 

问：选择外显子 2（在 SNCA 基因中）进行切割的原因是什么？

答：外显子 1 编码 5' UTR，而外显子 2 包含蛋白质编码区的起点。

 

问：是否可以在不使用 iPSC 的情况下进行此校正，例如使用 PD 患者的神经元？

答：不太可能。iPSC 的关键优势在于其可以进行多次传代而不会丧失基因组完整性和多能性。从 PD 患者身上获取大量原代神经元几乎是不可能的。PD 患者 iPSC 来源的神经元通常含有混合细胞类型，比 iPSC 更难培养。

问：我在分离单个 iPS 细胞时遇到问题。你们在实验中是否也存在这个问题？

答：正如我们在网络讲座中所讨论的，我们采用了三种基因组分析工具（体外切割检测、TaqMan® SNP 基因分型和 PGM 测序）来筛选和鉴定为克隆群体的集落。有时我们需要重新挑选和筛选子集（以低密度铺板）以识别正确的克隆。

问：是否可以使用复制缺陷型慢病毒来传递 TAL 质粒？这样能否提高效率？

答：有可能。我们从未尝试过该方法，因为我们希望生成无痕等基因系。使用慢病毒有可能会产生不必要的整合。

问：GBA 突变是否与其他神经疾病存在关联？

答：除了 PD，在患有路易体痴呆症的受试者中也发现了 GBA 突变。

问：合成 TAL 需要多长时间？

答：合成定制的 GeneArt® Precision TAL 通常需要 2 周时间

问：为了转化为目标生物体，是否必须在载体中构建 TAL？需要使用哪种载体？

答：GeneArt® Precision TAL 在 Gateway 入门载体中交付。您需要完成 LR 反应，将 TAL 功能结构域融合到目标载体中。有关详细信息，请参阅产品用户手册。

问：你们是否在 TALEN 或供体模板中使用了选择盒？

答：否。我们不希望在编辑后的细胞系中生成任何不必要的痕迹（外源序列）。

问：你们是使用质粒供体模板还是寡核苷酸模板？

答：我们使用了包含供体序列的纯化 PCR 片段（约 1 kb）。我们发现此方法比使用质粒效率更高。我们并未尝试使用单链寡核苷酸。

问：你们的供体模板上是否有筛选组织盒？

答：否。我们不希望在编辑后的细胞系中生成任何不必要的痕迹（外源序列）。

问：在 SNCA -/- 上，你们认为为何仍存在正确大小的蛋白质？也许是混合细胞群，而非克隆。

答：所显示的数据是将亲本细胞系与杂合基因敲除细胞系进行比较，而非纯合基因敲除细胞系。

问：你们是否能够确认 iPSC 中不存在仙台病毒序列？

答：是，使用我们 Life Technologies 的 TaqMan® iPS 仙台病毒检测试剂盒，货号 A13640

问：你们是否遇到过“主力”细胞系与实际使用的细胞系之间存在 TAL 活性差异？

答：由于主力细胞系的转染效率更高，因此在主力细胞系中检测到的切割活性要高于 iPSC。我们将重点放在了 iPSC 上，因此我们并没有对主力细胞系进行详细的基因组分析。

问：你们是否仅在单个克隆上测试了 TaqMan SNP 测定？该测定是否适合将一个孔中的所有细胞用于进行 TAL 功能初步验证，或者是否存在背景干扰过高的问题？

答：我们仅对单个克隆进行 TaqMan SNP 测定。筛选转染池时背景干扰可能会较高。为了检测细胞群中的罕见事件，采用 castPCR 技术的 TaqMan 突变检测测定是更好的替代选择。