区室化是数字 PCR 的基础
 

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1988年推出时，采用384孔板展示了罕见靶标检测的“有限稀释法”原理（1）。随着使用数字 PCR（dPCR）进行的 DNA 扩增和定量的发展，出现了试剂分装或腔室化方法。目前最常用的方法之一是使用微流体技术，通过乳化成液滴形成许多小的独立反应。这样就能在每个 dPCR 反应中产生成千上万个比现在体积小得多的液滴。增加液滴数量提高了检测罕见靶标的能力，增强了更高浓度下靶标检测的准确度，并且在本质上扩大了动态范围（2,3）。 


精确和准确的数字 PCR
 

Applied Biosystems QuantStudio Absolute Q 数字 PCR 系统借助其专有的微流体阵列式芯片板（MAP）技术，提供高度准确的 dPCR 结果。工作原理：

MAP（图1）具有16个 dPCR 反应单元，为不透明块，可轻松区分。放大后可看到，每个 dPCR 反应单元（不透明块）由 20,480 个固定阵列微反应室组成。微反应室本身通过一个用于输送 PCR 试剂的分配网络连接。试剂被分区到微反应室中，然后继续进行 PCR 扩增，对成功进行 DNA 扩增的微反应室数量进行计数。

Microfluidic array plate graphic
图1.微流体阵列式芯片板技术


与其它 dPCR 方法相比，具有更高的一致性
 

由于依赖于固有的随机过程（流体剪切）来创建单独的腔室，因此一些基于乳液或液滴的数字 PCR（dPCR）技术缺乏一致性。这可能导致每个 dPCR 反应生成的腔室的总数具有高度可变性。

另一方面，QuantStudio Absolute Q MAP 技术不依赖于液滴所用的流体剪切或多余试剂的物理位移来形成腔室或微反应室。因此，除了提供出色的一致性、减少试剂浪费并简化工作流程之外，MAP 技术还可提供更高的总体体积精度、更大数量的微反应室生成和更精确的定量。


查看数据
 

为证明 QuantStudio Absolute Q 系统上 MAP16 芯片板生成数据的类型，我们使用 QuantStudio Absolute Q 系统的所有4个光学通道检测靶标1（FAM）、靶标2（VIC）、靶标3（ABY）和靶标4（CY5），进行了多重检测。图2显示了 QuantStudio Absolute Q 分析软件根据 MAP16 芯片板上的单个反应生成的 dPCR 荧光图和微反应室阳性图。

Data MAP 16 plate
图2.显示使用4个通道进行多重检测的 MAP16 芯片板。


每次产生 20,000 个 dPCR 微反应
 

为突出微反应室填充的优异一致性，我们进行了一项研究，证明了高度可接受的微反应室计数在不同检测试剂盒的 MAP 之间具有重复性（图3）。本研究中，我们使用内部标准 QC 检测试剂盒运行了14块芯片板。在 dPCR 工作流程中，dPCR 完成后，QuantStudio Absolute Q 分析软件将立即使用 QC 通道找到并检查 dPCR 反应或阵列中的每个微反应室，并且仅接受均匀填充且无明显的非 PCR 相关自动荧光碎片迹象的微反应室。本研究中包含14个芯片板中，平均微反应室接受率为 99.7%（±0.6%）。我们为14个 MAP 各绘制了各阵列可接受微反应室的总数，以显示每个芯片板的整体一致性。20,480 处的虚线表示 MAP 上可用的微反应室总数。在所有阵列中，我们发现每个芯片板平均可接受 20,417（±133）个微反应室。

为什么分析微反应室的数量很重要？

因为统计是 dPCR 分析的根本。

使用泊松建模（上文），分析的微反应室总数和微反应室体积都可用于计算 dPCR 反应的最终浓度。因此，这两个变量的高度一致性和精确计算均非常关键。MAP 技术提高了可接受微反应室总数和总体体积精度的一致性，从而提高了整体定量分析的一致性。


其他资源
 


参考文献
 

  1. Saiki RK、Gelfand DH、Stoffel S 等人。使用热稳定 DNA 聚合酶对 DNA 进行引物引导的酶扩增。Science.1988;239(4839):487‐491.
  2. Huggett JF、Foy CA、Benes V 等人。数字 MIQE 指南：发表定量数字 PCR 实验所需提供的最低信息量。Clin Chem.2013;59(6):892‐902.
  3. Quan PL、Sauzade M、Brouzes E。dPCR：技术综述。Sensors (Basel).2018;18(4):1271.


仅供科研使用，不可用于诊断目的。

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