与胺反应的交联剂化学特性

使用与伯胺（–NH2）反应的化学基团，是交联或者标记多肽和蛋白质（例如抗体）最简单、最常用和通用的方法伯胺存在于每个多肽链的 N-端和赖氨酸（Lys，K）氨基酸残基的侧链中。这些伯胺在生理 pH 下带正电； 因此，它们主要发生在天然蛋白质三级结构的外表面上，很容易与引入水性介质中的结合试剂发生反应。此外，在典型的生物学或蛋白质样品的化学官能基团中，伯胺尤为具有亲核性，易与几个反应性基团靶向结合。

实际上，有许多合成化学试剂会与伯胺形成化学键。包括异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、NHS 酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸盐、芳基卤化物、酰亚胺酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯。其中，大多数通过酰化或烷基化与胺结合。

甲醛和戊二醛为进攻性羰基（–CHO）试剂，可通过曼尼希反应和/或还原胺化作用与胺缩合。在免疫组化（IHC）分析中，这些化合物用于固定和保存组织或细胞。硫氰酸酯基团为使用传统荧光标记试剂（称为 FITC，荧光素异硫氰酸酯）的研究人员所熟知。

但是，NHS 酯和酰亚胺酯是最常用的胺特异性官能基团，加入试剂中用于蛋白质交联和标记。

选择与胺反应的化学基团。官能基团常用于蛋白质生物学方法中。

NHS 酯反应化学

NHS 酯是通过羧酸盐分子的碳二亚胺活化形成的反应基团（参阅碳二亚胺交联剂化学）。NHS 酯活化的交联剂和标记化合物在生理至弱碱性条件下（pH 7.2 至 9）与伯胺反应，形成稳定的酰胺键。反应释放出 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。

化学偶联伯胺的 NHS 酯反应方案。R 代表具有 NHS 酯活性基团的标记试剂或交联剂的一端；P 代表含有靶官能基团（即伯胺）的蛋白质或其他分子。

NHS 酯水解与伯胺反应产生竞争。水解速率随缓冲液 pH 值的增加而增加，低浓度蛋白质溶液中的交联效率降低。在 pH 7.0 和 0°C 下，NHS-酯化合物的水解半衰期为 4 至 5 小时。在 pH 8.6 和 4°C 下，该半衰期降低至 10 分钟。在不含伯胺的水溶液中，NHS 酯水解的程度可以在 260 至 280 nm 处测量，因为 NHS 副产物在该范围内吸收峰。

NHS-酯交联反应最常在室温或 4°C 下于 pH 7.2-8.5 的磷酸盐、碳酸盐-碳酸氢盐、HEPES 或硼酸盐缓冲液中进行（0.5-4 小时）。与伯胺缓冲液（例如 Tris，TBS）不相容，因为它们会发生竞争反应。但是，在某些步骤中，结合步骤结束时可添加 Tris 或甘氨酸缓冲液以淬灭（停止）反应。

低浓度叠氮化钠（≤3 mM 或 0.02％）或硫柳汞（≤0.02 mM 或 0.01％）通常不会明显干扰 NHS-酯反应，但浓度较高时会产生干扰。不纯的甘油和高浓度甘油（20-50％）也会降低反应效率。

Sulfo(磺基)-NHS 酯除了在 N-羟基琥珀酰亚胺环上含有磺酸根（–SO3）外，其他部分与 NHS 酯相同。该带电基团对整个化学反应没有影响，主要用于增加含有它们的交联剂的水溶性。此外，带电基团可防止Sulfo-NHS 交联剂穿过细胞膜，使它们可用于细胞表面交联。

Sulfo-NHS 酯反应方案用于与伯胺发生化学结合。R 代表具有Sulfo-NHS 酯反应性基团的标记试剂或交联剂一端；P 代表含有靶官能基团（即伯胺，–NH2）的蛋白质或其他分子。

NHS-酯试剂的溶解度随缓冲液组成和分子结构其余部分（例如，间隔臂）的物理性质发生变化。许多非磺化 NHS-酯试剂是非水溶性的，必须首先溶解在可与水混溶的有机溶剂中（例如 DMSO 和 DMF）才能添加至水性反应混合物中。因此，与非水溶性NHS-酯发生交联反应通常需要在水性反应中加入 0.5-10％ 的有机溶剂。

NHS 与Sulfo-NHS 交联剂的对比。DSS 和 BS3（磺基-DSS）的化学结构。DSS 不能直接溶于水，一旦溶解便会穿过整个细胞膜，在细胞内部发生交联。BS3 是水溶性的（在常规工作浓度下），带电后不能穿细胞膜内，而将 BS3 交联局限在完整细胞表面上。

两端均具有 NHS 酯基的同型双功能交联剂（例如上述 DSS 和 BS³）主要用于将蛋白复合物中共价（永久）结合在一起的应用。尽管可以在任意两个蛋白质分子（相同或不同）的伯胺之间发生交联作用，但只有那些非随机紧密结合的蛋白质才能有足够的概率发生交联来进行检测。除非靶蛋白是随机聚合，否则很少使用这些胺-胺交联剂来交联无结合关系的蛋白。

该技术可用于发现或验证蛋白质相互作用或分析发生已知蛋白质相互作用的条件。实验可以在体外（使用复杂的细胞裂解物或假定的经过纯化的互作蛋白）进行，也可以在体内（细胞内或细胞表面）进行。使用适当的对照，检测不同复合物相对丰度（采用电泳和染色或蛋白质免疫印迹法((Western Blot)测定）可用于表明交联时的特定相互作用。通过对使用不同间隔臂长度或是否具有可剪切性或不同溶解性的交联剂的结果进行对比，阐明了相互作用的不同特征。

异型双功能 NHS-酯交联剂尤其适用于蛋白质相互作用分析，特别是那些两端相反且含有可光活化基团的交联剂。这些交联剂首先与纯化的“诱饵”蛋白发生反应（与伯胺发生 NHS-酯反应），然后添加到细胞或裂解物中，捕捉诱饵蛋白与“猎物”蛋白产生的相互作用。如果需要，可以使用紫外线激活交联剂的另一端，使其连接到诱饵蛋白首先遇到的任何化学基团上。在蛋白质相互作用复合物中，该反应将导致诱饵和猎物蛋白质相互作用物之间发生交联。以下Western Blot分析提供了体内使用交联试剂的一个示例。 

几种体内交联方法的对比。在淬灭前，用 PBS 中的 1％ 甲醛（HCHO）或 1 mM 同型双功能 NHS-酯交联剂（Thermo Scientific DSG and DSS）处理 HeLa 细胞 10 分钟。根据步骤，对第四组 HeLa 细胞进行处理并与 4 mM Photo-亮氨酸、2 mM Photo-蛋氨酸（Photo-AA）交联 10 分钟。分别用 100 mM 甘氨酸 pH 3 和 500mM Tris pH 8.0 对经甲醛处理的细胞和经 NHS-酯处理的细胞进行淬灭，用时 15 分钟。然后将每种实验条件下的106细胞裂解，并将 10 μg 的每个样品在 65°C 下含 50 mM DTT 的还原缓冲液中加热 10 分钟，然后使用 SDS-PAGE 和 Stat3 特异性抗体进行Western blot分析（细胞信号传导）。使用 GAPDH（Santa Cruz）和 β-actin（US Biologicals）作为内参进行Western Blot分析。

使用一端具有 NHS 酯基而另一端具有不同反应性基团的异型双功能交联剂（例如巯基马来酰亚胺）产生特异性蛋白质复合物。

例如，纯化抗体与辣根过氧化物酶的结合，产生用于 ELISA 的抗体-HRP 结合物。又如，肽抗原与 KLH 或其他载体蛋白的结合，制备有效的免疫原。Sulfo(磺基)-SMCC是该方法最常用的交联剂。SM（PEG）_n交联剂类似于 SMCC，因其所含聚乙二醇（PEG）单元的数量不同而具有不同的间隔臂长。

由于涉及不同的官能基团，反应可以以受控的、逐步的方式进行。在这两个示例中，可以使用 NHS-酯基团单独激活一个蛋白质中的胺； 当加入第二个蛋白质（带有巯基的蛋白质）时，它会与交联剂另外一端交联，从而与第一个蛋白连接。。常用蛋白质（例如 HRP 或 KLH）提供商业化的预活化形式（即与 SMCC 的 NHS 酯反应已经完成）。在该示例实验中，半胱氨酸偶联检测用于评估马来酰亚胺活化的载体蛋白的活性。 

高活性的Thermo Scientific Imject 马来酰亚胺活化载体蛋白。Imject 载体蛋白的表面伯胺（即赖氨酸侧链）通过与过量的 Thermo Scientific Pierce Sulfo-SMCC 交联剂反应而带有活化的马来酰亚胺基团。活化水平（马来酰亚胺摩尔数/克载体蛋白）用半胱氨酸偶联法测定。KLH 和 蓝载体蛋白非常大（约 8000 kDa），每个蛋白质分子使用 600 至 900 个带有马来酰亚胺基团的交联剂激活。BSA 和卵清蛋白较小（分别为 67 kDa 和 45 kDa），每个蛋白质分子使用 5 至 20 个带有马来酰亚胺基团的交联剂激活。

抗体和蛋白质最常用、最有效的生物素化和荧光标记试剂是 NHS-酯化合物。其受欢迎程度、可用性和在标记分析中的广泛应用至少有两个原因：

• 生物素和许多荧光化合物天然含有羧基，或容易带上羧基，可以使用碳二亚胺化学法（通常为 DCC）轻松衍生化以生成 NHS-酯化合物。
• 最常见的标记靶标是大蛋白，例如抗体（IgG 的分子量为150,000），具有 10 至 15 个易于反应的赖氨酸胺，NHS-酯化合物可与这些赖氨酸胺发生反应以获得所需的亲和力或检测标签。

为了进行后续的荧光Western blot检测，使用荧光基团偶联二抗检测癌细胞裂解物中的靶蛋白 ERK1。 

使用 DyLight 755 二抗进行 ERK1荧光Western Blot检测。使用小鼠抗 ERK1 一抗和结合 DyLight 755（使用DyLight 755 微型抗体标记试剂盒）的山羊抗小鼠二抗，通过Western Blot分析 A562 细胞裂解连续稀释液中的 ERK1 水平。左侧泳道：红外蛋白marker。

4.固定化抗体和其他蛋白质

琼脂糖树脂、磁性颗粒和其他几种类型的固体支持物均可以 NHS-酯基团活化形式提供。这些活化的支持物将稳定且有效地与蛋白质或其他含胺的配体结合，将其固定化并用于亲和纯化步骤。如上所述，NHS 酯易水解；因此，NHS-琼脂糖和类似的活化树脂始终以干燥物或在有机溶剂（通常是丙酮）中以浆状形式提供。

用于将蛋白质固定在琼脂树脂上的 NHS 酯的重要替代品是醛还原树脂，可通过还原胺化作用进行结合。有关此相关胺固定化法（AminoLink 产品）的更多信息，参见羰基-反应化学交联剂页面。

此外，上述同型双功能 NHS 交联剂（如 DSS）常用于在免疫沉淀（IP）过程中将抗体固定在固相介质/微球上。这种“Crosslink IP”方法（也称为 IgG Orientation）包首先将纯化的 IP 抗体与蛋白质 A/G 琼脂糖树脂结合，然后添加 DSS，通过各自的伯胺来共价交联抗体和蛋白质 A/G 。以下电泳结果展示了使用交联 IP 方法获取的结果。 

使用 IgG 与 NHS 活化琼脂糖偶联，来进行特异蛋白质纯化。将人 IgG（25 mg）固定在 1 mL Pierce NHS 活化琼脂糖上。亲和树脂用于纯化大肠杆菌中分泌的重组 G 蛋白。最终得到 25 mg 蛋白质。泳道 1：细菌沉淀，泳道 2：蛋白marker，泳道 3：培养上清液，泳道 4：流穿液，泳道 5-12：洗脱液，泳道 13：洗脱后的煮沸树脂。

酰亚胺酯交联剂与伯胺反应形成脒键。酰亚胺酯交联剂在碱性 pH 下可与胺快速反应，但半衰期短。随着 pH 值碱性更强，半衰期和与胺的反应性增加；因此，pH 10 比 pH 8 时的交联更有效。在 pH 8-10 之间有利于形成脒，低于 pH 10 的反应条件可引起副反应。单官能烷基酰亚胺酯的应用研究表明，在 pH <10 时，仅一个酰亚胺酯官能基团即可形成交联。在较低的 pH 范围内形成中间的 N-烷基亚胺酯，与附近的其他胺交联生成 N，N'-脒衍生物，或转化为脒键。在较高的 pH 下，直接形成脒而不形成中​​间产物或副产物。当使用巯基可剪切的二亚氨基酯时，pH 低于 10 时发生的无关交联有时会干扰结果解析。

与伯胺发生化学交联的亚氨基酯反应方案。R 代表标记试试剂或具有酰亚胺酯反应性基团的交联剂一端。P 代表含有官能基团（即伯胺，-NH₂）的蛋白质或其他分子。

同型双功能酰亚胺酯交联剂已用于研究膜中的蛋白质结构和分子缔合，并将蛋白质固定在固相支持物上。生成的脒发生质子化，在生理 pH 下带正电； 在某种程度上，保留了它所取代的原始胺的天然电荷性质，可能有利于某些实验。还研究了将酰亚胺酯交联剂用作戊二醛替代品用于组织固定。尽管酰亚胺酯具有电荷属性，但仍可穿透细胞膜并发生膜内蛋白质交联，用于研究膜的组成、结构以及蛋白质:蛋白质和蛋白质:脂质相互作用。这些交联剂也已用于测定或确认多亚基蛋白质中亚基的数量和位置。在这些实验中，使用大摩尔过量交联剂（100 至 1000 倍）和低浓度蛋白质（小于 1 mg/mL）来促进分子内交联而不是分子间交联。

尽管某些步骤仍使用酰亚胺酯，但形成的脒键在高 pH 下可逆。因此，在大多数分析应用中，更稳定、有效的 NHS-酯交联剂已逐步将其取代。

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