染色质免疫沉淀（ChIP 实验） | Thermo Fisher Scientific

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染色质免疫沉淀（ChIP）实验通过组蛋白修饰（表观遗传学）或转录因子-DNA 结合相互作用，监测转录调控，识别基因组和蛋白质组之间的联系。ChIP 实验的优势在于能够捕捉系统中特定蛋白质-DNA 相互作用，并使用定量聚合酶链反应（qPCR）对相互作用进行量化。染色质免疫沉淀实验需要多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质-DNA 提取）、核酸剪切、抗体免疫沉淀、DNA 样本回收和 PCR。在优化实验中，通常使用凝胶电泳等附加技术来验证特定步骤。

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第 1 步：交联

染色质免疫沉淀（ChIP）实验始于稳定的共价的蛋白质-DNA 复合物。许多蛋白质与 DNA 的相互作用是短暂的，涉及多种蛋白质复合物来协调生物功能。体内交联共价稳定蛋白质-DNA 复合物。

体内交联传统上是用甲醛实现的，但可以与其他交联剂如 EGS 和 DSG 结合使用。甲醛交联是两种直接相互作用的分子的理想选择。然而，甲醛是一种零长度的交联剂，限制了其功能性。。对于更高阶相互作用，较长的交联剂如 EGS (16.1 Å) 或 DSG (7.7 Å) 可以捕获具有复杂四元结构的较大蛋白质复合物。

研究人员经常使用交联剂的组合来捕获蛋白质-DNA 相互作用。这些交联剂直接渗透到完整的细胞中，有效地将蛋白质-DNA 复合物锁在一起，即使是短暂的相互作用复合物也能被捕获并稳定下来进行分析。

这张图描绘了共价蛋白质-DNA 在细胞核内的相互作用。

成功的染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验的分步指南

此更新的 ChIP 程序概述包括有关主要抗体选择（即 ChIP验证抗体）的附加细节。该技术文档还描述并提供染色质免疫沉淀（ChIP）作为研究表观遗传学的技术的例子，因为它允许研究人员获得特定蛋白质-DNA 相互作用的快照。

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第 2 步：细胞裂解

裂解阶段从细胞或组织中提取交联蛋白-DNA 复合物，让它们进入溶液。在这个阶段，通过去污剂溶液溶解细胞膜，从而释放细胞组分。由于蛋白质和 DNA 的相互作用主要发生在核内，去除胞浆蛋白有助于减少背景和提高灵敏度。去污剂或盐的存在不会影响蛋白质-DNA 复合物，因为在第一步中实现的共价交联将在整个 ChIP 过程中保持复合物的稳定性。

不建议对细胞进行机械裂解，因为这会导致效率不高的核裂解。例如 Thermo Scientific Pierce 染色质制备模块这样的试剂，它可以将核组分与其他细胞成分分离，用来消除背景信号，提高灵敏度。

这张图说明了在经过裂解的细胞中蛋白质和 DNA 的相互作用。

蛋白质制备手册

在这本 32 页的手册中，了解如何使用各种 Thermo Scientific 蛋白质生物学工具从蛋白质样本、免疫沉淀和其他蛋白质纯化和净化方法中脱盐、缓冲交换、浓缩和/或去除污染物。

免疫沉淀（IP），共沉淀和染色质免疫沉淀
重组蛋白纯化标签
使用 slide-a-lyzer 透析盒和装置安全地透析蛋白质样品
利用 zeba 旋转脱盐柱和板以高蛋白回收率使得样品快速脱盐
用优化的去污剂或内毒素去除树脂有效地提取特定污染物
用 Pierce 蛋白浓缩器快速浓缩稀释的蛋白质样品

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第 3 步: 染色质制备（剪切/消化）

提取步骤产生所有核材料，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白-DNA 复合物。为了分析蛋白质结合序列，提取的基因组 DNA 必须被剪切成更小的可行片段。DNA 裂解通常是通过机械的超声波或微球菌核酸酶（MNase）消化来实现的。

理想的染色质片段范围在 200 到 1000 bp 之间；然而，DNA 剪切是最难控制的步骤之一。超声波提供真正随机的片段，但局限性包括可能需要协调一致的专用设备、超声波过程中难以保持温度、延长的实际操作时间和更多的优化步骤。用微球菌核酸酶进行酶消化具有高度的可重复性，更适合于处理多个样品，但由于酶活性的变化和酶对核小体间区域具有更高的亲和力，该消化过程可能导致变异。

该图说明了蛋白质-DNA 复合物之间的相互作用，并描绘了剪切的基因组 DNA。

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蛋白质核酸相互作用概述

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第 4 步：免疫沉淀

为了分离特定的修饰组蛋白、转录因子或相关的辅助因子，ChIP 验证抗体被用于免疫沉淀并从其他核成分中分离出目标。这一步骤有选择地富集了目标蛋白质-DNA 复合物，并消除了所有其他无关的细胞材料。

选择合适的抗体是 ChIP 实验成功的关键步骤。对于哺乳动物样本，有许多 ChIP 级抗体可用于该步骤的验证。对于无法获得合格抗体的靶蛋白，可在生物样品中表达 HA、myc 或 GST 等融合蛋白，然后利用针对亲和标记的抗体对靶蛋白进行免疫沉淀。

抗体-蛋白质-DNA 复合物通过抗体结合树脂（如固定化蛋白 A、蛋白 G 或蛋白 A/G）亲和纯化。对于生物素化抗体，也可以使用固定化链霉亲和素或固定化 Thermo Scientific NeutrAvidin 蛋白。为了减少背景，有必要结合核酸和蛋白质阻断缓冲液（如鲑鱼精子 DNA 和普通蛋白质源）来阻断抗体结合珠。每个 ChIP 样品中使用的磁珠体积也会影响背景，因为磁珠体积的增加会增加非特异性结合。

此图显示了免疫沉淀的靶蛋白和交联核苷酸序列。随后，DNA 被分离，通过 PCR 鉴定，测序，应用于微阵列，或以其他方式分析。

查看此视频了解更多免疫沉淀信息

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第 5 步：解交联与 DNA 净化

与目标蛋白质结合的 DNA 富集是染色质免疫沉淀的目标。DNA 水平可通过琼脂糖凝胶电泳或更常用的定量聚合酶链反应（qPCR）测定。在染色质免疫沉淀实验的特定 DNA 产物被扩增和测量之前，蛋白质和 DNA 之间必须解交联。这通常是通过广泛的热孵育或通过蛋白酶 K 消化蛋白质组分来完成的。

蛋白酶 K 剪切在脂肪、芳香或疏水残基的羧基侧。由于其广泛的特异性，蛋白酶 k 常被用于从 DNA 或 RNA样本制备中去除蛋白质。此外，蛋白酶 k 的消化消除了纯化 DNA 中的核酸酶，从而防止降解。为了从蛋白质片段中分离 DNA，酚氯仿与标准 DNA 纯化方法结合使用。或者，可以使用设计用于从复杂生物样品中纯化核酸材料的纯化柱。