293fectin™ Transfection Reagent

相关产品信息

介绍

293fectin™ 是一种具有专利技术的阳离子脂质体制剂，用于将 DNA 转染至真核细胞中。293fectin™ 经过优化可在成分明确的无血清 FreeStyle™ 293 表达培养基中转染悬浮 293 人胚肾细胞（例如 FreeStyle™ 293-F 细胞，货号 R790-07），适用于与 FreeStyle™ 293 表达系统（货号 K9000-01）配合使用。

优势

293fectin™ 已经过优化可在成分明确的无血清 FreeStyle™ 293 表达培养基（货号 12338-018）中转染悬浮 293 细胞（例如 FreeStyle™ 293-F 细胞，货号 R790-07）。使用 293fectin™ 可获得以下优势：

  • 表明 293fectin™ 对悬浮 293 细胞具有高转染效率，也适合转染贴壁 293 细胞。
  • 可在 FreeStyle™ 293 表达培养基中转染悬浮 FreeStyle™ 293-F 细胞；无需更换培养基。
  • 可将 DNA-293fectin™ 复合物直接添加到培养基中的细胞中。
  • 转染后无需去除复合物或者更换或添加培养基。

转染指南

  • 要获得出色的转染效率，我们建议在 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-062）中稀释 293fectin™，然后形成与 DNA 的复合物。
  • 确保您的质粒 DNA 制备液干净、无菌且不含苯酚和氯化钠。污染物可能会杀死细胞，盐会干扰复合作用，从而降低转染效率。我们建议使用其中一个 PureLink™ HiPure 质粒试剂盒（货号 K2100-14 或 K2100-16）分离质粒 DNA。

推荐转染条件

在 FreeStyle™ 293 表达培养基中转染悬浮 293 细胞时，请使用以下优化条件。如需以较大的体积进行转染实验，仅需相应地按比例增加试剂体积。

  • 最终转染体积：30 mL。
  • 要转染的细胞数：在 FreeStyle™ 293 表达培养基中培养的 3 × 107 个细胞（最终细胞密度：1 × 106 个细胞/mL）。请确保继续进行转染前细胞健康且存活率超过 90%。
  • 质粒 DNA 用量：20-40 μg（我们通常使用 30 μg）。
  • 293fectin™ 用量：40-80 μL（我们通常使用 60 μL）。每转染 1 μg 质粒 DNA，使用 2 μL 293fectin™。

转染悬浮细胞

按照以下方案转染 30 mL 体积的悬浮 293 细胞。您可以在转染期间将细胞保存在 FreeStyle™ 293 表达培养基中。请勿在转染期间向培养基中添加选择性抗生素，因为这可能会降低转染效率。我们建议加入一份阳性对照和一份阴性对照（无 DNA、无 293fectin™），以帮助您评估结果。

  1. 在转染前一天，确定转染所需的细胞数量。每转染 30 mL，您将需要 28 mL FreeStyle™ 293 表达培养基中的 3 × 107 个细胞。根据细胞倍增时间相应地扩增细胞。对于 FreeStyle™ 293-F 细胞，这相当于以约 6-7 × 105 个细胞/mL 的浓度传递细胞。
  2. 转染当天，使用台盼蓝染料排斥法测定一小份细胞的存活率和细胞结团量。剧烈涡旋 45 秒以打散细胞团块，并使用 Coulter 计数器或血细胞计数器测定细胞总数。细胞存活率必须超过 90%。重要提示：为获得出色结果，请确保准备好单细胞悬浮液。可能需要剧烈涡旋细胞 10 至 30 秒以打散细胞团块。
  3. 计算包含一次转染所需细胞数的细胞悬浮液体积（每转染 30 mL 需要 3 × 107 个细胞）。将含有细胞的摇瓶置于 37°C 培养箱的定轨摇床上。
  4. 对于每份转染样本，通过进行以下操作制备脂质体-DNA 复合物
    ：

    • 在 Opti-MEM® I 中稀释 30 μg 质粒 DNA，使得总体积为 1 mL。轻轻混匀。
    • 在 Opti-MEM® I 中稀释 60 μL 293fectin™，使得总体积为 1 mL。轻轻混匀并在室温下孵育 5 分钟。
      注：孵育时间较长可能会导致活性下降。
    • 孵育 5 分钟后，将稀释的 DNA 添加至稀释的 293fectin™ 中，使得总体积达到 2 mL。轻轻混匀。
    • 在室温下孵育 20-30 分钟以形成 DNA-293fectin™ 复合物。
  5. 在孵育 DNA-293fectin™ 复合物的同时，从培养箱中取出细胞悬浮液，并将适当体积的细胞混悬液（参见步骤 3）添加至无菌一次性 125 mL 锥形摇瓶中。每转染 30 mL，均添加总体积为 28 mL 的新鲜、预热 FreeStyle™ 293 表达培养基。
  6. DNA-293fectin™ 孵育完成后，将 2 mL DNA-293fectin™ 复合物（来自步骤 4）添加至每个含细胞悬浮液的摇瓶中。向阴性对照摇瓶中加入 2 mL Opti-MEM® I，而非 DNA-293fectin™ 复合物。各摇瓶的总体积应为 30 mL，含约 1 × 106 个活细胞/mL。
  7. 在设置为含 8% CO2 的湿润环境的 37°C 培养箱中，在转速为 125 rpm 的定轨摇床上孵育细胞。
  8. 在转染后约 48 小时收获细胞或培养基（如果分泌重组蛋白），并测定重组蛋白表达。

转染贴壁细胞

按照以下方案在 24 孔板中转染贴壁 293 细胞。如果您使用的是较大或较小的组织培养板，则根据表面积差异按比例改变转染条件（即接种密度，DNA、293fectin™ 和培养基用量）。

  1. 转染前一天，对细胞进行胰蛋白酶化处理和计数。转染当天以 2 × 105 个细胞/孔的密度对细胞进行铺板，使其达到 90%-95% 汇合度。在含有血清的 0.5 mL 细胞正常生长培养基中对细胞进行铺板。请勿使用选择性抗生素。
  2. 转染当天，通过执行以下操作制备各样本的脂质体-DNA 复合物：

    • 在 Opti-MEM® I 中稀释 0.8-1.0 μg 质粒 DNA，使得总体积为 50 μL。轻轻混匀。
    • 在 Opti-MEM® I 中稀释 2-3 μL 293fectin™，使得总体积为 50 μL。轻轻混匀并在室温下孵育 5 分钟。注：孵育时间较长可能会导致活性下降。
    • 孵育 5 分钟后，将稀释的 DNA 添加至稀释的 293fectin™ 中，使得总体积为 100 μL。轻轻混匀。<
    • 在室温下孵育 20-30 分钟以形成 DNA-293fectin™ 复合物。
  3. 将 100 μL DNA-293fectin™ 复合物添加至各孔中，并通过来回摇动平板轻轻混匀。
  4. 在 37°C 培养箱中孵育细胞 24-48 小时，然后测定重组蛋白表达。

优化蛋白表达

表达水平可能因重组蛋白的性质而异；因此，您可能需要在转染后 24、48、72、96 小时收获细胞或培养基来进行时程实验，以优化重组蛋白的表达。

100004835   2008 年 9 月 4 日