DMRIE-C Reagent

相关产品信息

介绍

描述

DMRIE-C 试剂适用于将 DNA (1,2) 和 RNA (3,4) 转染到真核细胞中，并且可以特别有效地转染悬浮细胞（例如 Jurkat）和其他淋巴衍生细胞系。有关成功转染的细胞类型列表，请参阅 www.invitrogen.com 中的细胞系数据库。DMRIE-C 也可用于体内递送 DNA (5)。DMRIE-C 是阳离子脂质体 DMRIE（1,2-二十四烷氧基-丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵）(6) 和胆固醇溶于膜过滤水的 1:1 (M/M) 脂质体制剂。

转染重要指南

  1. 使用推荐量的 DNA（或 RNA）和 DMRIE-C 形成复合物。必要时进行优化。注：我们建议在 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-062）中稀释 DNA（或 RNA）和 DMRIE-C，然后形成复合物。

  2. DMRIE-C 是一种脂质悬浮液，可随时间沉降。使用前倒置试管 5-10 次使溶液彻底混合。

  3. 在推荐的汇合度或细胞密度下转染细胞。必要时进行优化。在实验之间保持相同的接种条件。

  4. 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。

  5. 为获得出色结果，请在不含血清的培养基中进行转染。如需要，可以在含血清的情况下转染细胞；然而，必须在无血清培养基中形成复合物。

  6. 检测无血清培养基与 DMRIE-C 的兼容性，因为一些无血清制剂（例如，CD 293、293 SFM II、VP-SFM）可能会抑制阳离子脂质体介导的转染。

  7. 提供程序，以 6 孔规格（稳定转染 DNA 使用 60 mm 规格）转染细胞。对于其他规格，则根据组织培养容器的相对表面积按比例改变 DNA（或 RNA）、DMRIE-C、细胞和培养基的用量。


本产品仅供实验室研究使用。注意：不适用于诊断。尚未确定本产品在诊断或其他临床应用中的安全性和有效性。

使用 DNA 转染贴壁哺乳动物细胞

使用以下程序将 DNA 瞬时或稳定地转染到哺乳动物细胞中。所有用量和体积均按每孔给出。

  1. 转染前一天，在不含抗生素的生长培养基中对细胞进行铺板，确保转染时细胞处于推荐的汇合度下。


    2. 条件细胞数生长培养基体积规格转染时的汇合度
    瞬时1-2 x 1052 mL6 孔60%-80%
    60%-80%1-2 x 1054 mL60 mm30%-50%


  2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：


    • a. 在 500 μL（稳定转染为 1 mL）不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基（或其他培养基）中稀释 1-2 μg DNA。

    • b. 使用前混合 DMRIE-C，然后在 500 μL（稳定转染为 1 mL）不含血清的 Opti-MEM® I 培养基（或其他培养基）中稀释 2-12 μL DMRIE-C。在室温下静置 30-45 分钟。

    • c. 将已稀释的 DNA 与已稀释的 DMRIE-C 合并（总体积 = 1 mL；稳定转染为 2 mL）。轻轻混匀并在室温下孵育 15-45 分钟（溶液可能变得浑浊）。

  3. 从细胞中去除生长培养基，并使用 2 mL 不含血清的生长培养基洗涤一次。去除洗涤培养基。

  4. 将复合物（步骤 2c）添加到细胞中。通过来回摇动平板轻轻混匀。

  5. 在 CO2 培养箱中于 37° C 下孵育细胞 4-24 小时。

  6. 将培养基更换为 2 mL 含血清的生长培养基（稳定转染为 4 mL）。或者，添加 1 mL 含 2X 正常浓度血清（稳定转染为 2 mL）的生长培养基，无需去除含 DNA 的培养基。

  7. 瞬时：转染后 24-72 小时检测转基因表达。稳定细胞系：在转染后 48-72 小时，按 1:5 的稀释度（或更高稀释度）将细胞传代至选择性培养基中。

使用 DNA 转染悬浮哺乳动物细胞

  1. 使用以下程序以 6 孔规格转染悬浮液中的哺乳动物细胞。所有用量和体积均按每孔给出。

  2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：

    • a. 将 500 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基（或其他培养基）等分至孔中。使用前混合 DMRIE-C，然后将 2-12 μL 稀释到培养基中，并通过涡旋平板轻轻混匀。

    • b. 在 12 x 75 mm 聚苯乙烯试管中，在 500 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 培养基（或其他培养基）中稀释 4 μg DNA。

    • c. 向含经稀释的 DMRIE-C 的孔中加入经稀释的 DNA（总体积 = 1 mL）。通过涡旋混合平板，并在室温下孵育 15-45 分钟（溶液可能变得浑浊）。

  3. 形成复合物时，使用储备细胞制备单细胞悬浮液。使用不含抗生素的无血清生长培养基洗涤细胞一次，并向各孔中加入 2-3 x 106 个细胞（溶于 0.2 mL 不含抗生素的无血清生长培养基）。

  4. 在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 4-5 小时。

  5. 向细胞中加入 2 mL 含 15% 胎牛血清的生长培养基。注：对于 Jurkat 和 MOLT-4 细胞，如需要，加入 1 μg/mL PMA 和 50 ng/mL PHA，以增强启动子活性和基因表达。对于 K562 和 KG-1 细胞，仅添加 PMA。

  6. 转染后 24-48 小时检测转基因表达。
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使用 RNA 转染哺乳动物细胞

使用以下程序以 6 孔规格转染含 RNA 的哺乳动物细胞。所有用量和体积均按每孔给出。

  1. 转染前一天，在 2 mL 不含抗生素的生长培养基中对 2-3 x 105 个细胞进行铺板，使得转染时的汇合度达到 80%。

  2. 临转染前，从细胞中去除生长培养基，并使用 2 mL 不含血清的生长培养基洗涤一次。去除洗涤培养基。然后转到步骤 3。

  3. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：

    • a. 向 12 x 75 mm 聚苯乙烯试管中加入 1 mL 不含血清的 Opti-MEM® I 培养基（或其他培养基）。使用前混合 DMRIE-C，然后将 2-12 μL 稀释到培养基中。短暂混合或涡旋。

    • b. 向含 DMRIE-C 和培养基的管中加入 2-5-5 μg RNA（步骤 3a）。短暂混匀或涡旋，然后立即加入复合物以洗涤细胞。

  4. 在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育 4 小时，然后将转染培养基更换为完全生长培养基。

  5. 转染后 16-24 小时对转染后的 RNA 的表达进行检测。注：加帽和多腺苷酸化 mRNA 在细胞内被更高效地翻译，且更稳定。

优化转染

为获得较高的转染效率且产生的非特异性影响较低，通过改变细胞密度、DNA（或 RNA）和 DMRIE-C 浓度以及转染孵育时间优化转染条件。

质量控制

用血琼脂平板、沙氏葡萄糖琼脂平板和液体巯基乙酸盐培养基检测 DMRIE-C 是否不存在微生物污染，并通过用报告基因质粒转染 Jurkat 细胞对其进行功能检测。还使用球蛋白 mRNA 作为底物，检测 DMRIE-C 是否不存在 RNase 活性。

参考文献

1.Ciccarone, V., et al.(1995) Focus® 17, 84.

2.Macdonald, A.S., et al.(1996) Focus® 18, 6.

3.Ciccarone, V., et al.(1994) Focus® 16, 94.

4.Schifferli, K.P. and Ciccarone, V. (1996) Focus® 18,45.

5.Logan, J.J., et al.(1995) Gene Therapy 2, 38.

6.Felgner, J.H., et al.(1994) J. Biol.Chem.269, 2550.
10459.pps      2010 年 5 月 13 日