protocol

介绍

Invitrogen FreeStyle 293 表达系统设计用于在成分明确的无血清培养基中大规模转染悬浮 293 人胚肾细胞。该系统包含 Invitrogen FreeStyle 293-F 细胞，这些细胞适应在 Invitrogen FreeStyle 293 表达培养基中无血清悬浮培养。转染和表达实验可以直接在 FreeStyle 293 表达培养基中进行，无需更换培养基。完整的 FreeStyle 293 表达试剂盒提供了足够的试剂，能够以 30 mL 的体积进行 16 次转染，但也可以简单地按比例增加试剂从而进行更大体积的转染。

FreeStyle 293 表达系统的组分

FreeStyle 293 表达系统包含以下主要组分：

  • FreeStyle 293-F 细胞：该细胞系适应在 FreeStyle 293 表达培养基中进行高密度、无血清悬浮培养，并且能够产生高水平的重组蛋白（更多信息参见下文）。
  • FreeStyle 293 表达培养基：这是一种成分明确的无血清培养基，专门配制用于培养和大规模转染悬浮 FreeStyle 293-F 细胞。
  • Invitrogen 293fectin 转染试剂：该转染试剂可以在悬浮 FreeStyle 293-F 细胞中实现较高的转染效率。

FreeStyle 293-F 细胞

FreeStyle 293-F 细胞系随 FreeStyle 293 表达系统提供，并且来源于 293 细胞系（参见下文）。FreeStyle 293-F 细胞适应在 FreeStyle 293 表达培养基中悬浮培养。冷冻细胞随 FreeStyle 293 表达培养基提供，并且可以直接在该培养基中解冻（参见“解冻和建立细胞”）。

亲本细胞系

293 细胞系是由剪切过的人腺病毒 5 型 DNA 转化的原代人胚肾细胞建立的永久细胞系（Graham 等人，1977；Harrison 等人，1977）。这些细胞可表达 E1A 腺病毒基因，该基因参与到一些病毒启动子的反式激活过程中，这一机制使得这些细胞能够表达非常高水平的蛋白。

随 FreeStyle 293 表达系统提供的 FreeStyle 293-F 细胞系是 293 细胞系的变体，该细胞系适应在 FreeStyle 293 表达培养基中悬浮生长。293-F 细胞系获取自 Pharmacopeia 的 Robert Horlick。

FreeStyle 293-F 细胞的特性

FreeStyle 293-F 细胞系具有以下特性：

  • 由来源于亲本 293-F 细胞（经有限稀释进行重新克隆）的低代数主细胞库培养物制备。293 克隆衍生培养物在无血清条件下的总传代数仅培养至 30 至 35 代。
  • 适应高密度、无血清、悬浮生长，并可在 FreeStyle 293 表达培养基中培养。
  • 使用 293fectin 表现出高转染效率。
  • 悬浮培养物可在 FreeStyle 293 表达培养基中转染，无需更换培养基。
  • 可进行大体积细胞转染。

注：其他 293 细胞系也可与 FreeStyle 293 表达系统配合使用。然而，在将这些细胞系用于转染研究之前，必须让细胞适应在 FreeStyle 293 表达培养基中进行无血清悬浮培养，并评估转染和表达。

FreeStyle 293 表达培养基

介绍

FreeStyle 293 表达培养基是一种成分明确的无血清培养基，专门为 293 细胞的高密度悬浮培养和转染而开发。培养基不含人源或动物源性组分。

培养基的特点

FreeStyle 293 表达培养基具有以下特点：

  • 经优化的无血清、无蛋白配方，设计用于支持悬浮 293 细胞（例如 FreeStyle 293 细胞）的高密度培养和转染。不建议将该培养基用于贴壁 293 细胞培养。
  • 即用型培养基，不需要添加补充剂。
  • 不含人源或动物源性产品。
  • 采用 Gibco™ GlutaMAX™-I（见下文）配制，可增加稳定性并尽可能延长有效期。
  • 支持 FreeStyle 293-F 细胞在生物反应器中进行大规模、高密度生长。

GlutaMAX-I

GlutaMAX-I 培养基含有二肽 L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（一种稳定形式的 L-谷氨酰胺）。使用 GlutaMAX-I 培养基的优点：

  • L-谷氨酰胺在储存或孵育期间不会降解
  • 尽可能减少氨蓄积
  • 可控制谷氨酰胺递送
  • 使用时无需添加 L-谷氨酰胺。

注：GlutaMAX-I 仅能通过细胞代谢从培养基中去除。由于自发分解，无毒性代谢物蓄积。

FreeStyle 293-F 细胞在培养基中的生长特性

通常，在 FreeStyle 293 表达培养基中培养的 FreeStyle 293-F 细胞会表现出以下特性：

  • 倍增时间范围为 20-25 小时注：在细胞解冻后的前几次传代期间，倍增时间可超过 25 小时。
  • 在振荡或旋动培养时，细胞密度高达 3 x 106 个细胞/mL
  • 在生物反应器中培养时，细胞密度高达 4 x 106 个细胞/mL

注：单独的培养和传代技术结合 FreeStyle293-F 细胞群固有的细胞异质性可能导致出现实验变异性。

方法

通用细胞处理

按照以下通用指南培养和维持 FreeStyle 293-F 细胞。

  • 与细胞接触的所有溶液和设备必须无菌。始终使用适当的无菌技术，并在层流净化罩中操作。
  • 在开始实验之前，请确保已建立细胞，并且备有一些冻存细胞。我们建议使用早代细胞进行实验。收到细胞后，培养并冷冻多管 FreeStyle 293-F 细胞系，以确保早代细胞供应充足。
  • 对于细胞的一般维持，当 FreeStyle 293-F 细胞密度达到约 1-3 × 106 个活细胞/mL（通常每 3-4 天）时，对细胞进行传代。
  • 使用台盼蓝拒染法测定细胞活力（见下文）。对数期培养物中的活细胞应 >90%。
  • 解冻或传代培养细胞时，将细胞转移至预热培养基中。

注意：与其他人细胞系一样，当使用 FreeStyle 293-F 细胞时，在至少生物安全 2 级防护条件下作为潜在生物危害性材料进行处理。

制备培养基

对于悬浮生长和转染应用，使用：

  • 原样 FreeStyle 293 表达培养基。不需要补充剂。
  • 不建议使用抗生素；但是，在需要时可使用含有青霉素、链霉素和两性霉素 B 的 5 mL/L 抗生素-抗真菌剂（货号 15240）。

重要提示：FreeStyle 293 表达培养基对光非常敏感。为获得出色结果，请在避光条件下使用和储存培养基。

测定细胞密度和活力

请按照如下程序，测定活细胞和细胞总数。

  1. 将一小份细胞悬浮液等份试液转移至微量离心管中。
  2. 使用台盼蓝拒染法测定细胞结团的活力和数量。
  3. 剧烈涡旋 10-30 秒以打散细胞团块。
  4. 使用 Coulter 计数器以电子方式或使用血细胞计数器手动测定细胞密度。

解冻和建立细胞

介绍

按照以下方案，解冻 FreeStyle 293-F 细胞以启动细胞培养。FreeStyle 293-F 细胞系以管装形式提供，一管含有 1 mL 细胞，密度为 1 x 107 个活细胞/mL，悬浮于 90% FreeStyle 293 表达培养基和 10% DMSO 中。直接在随试剂盒提供的 FreeStyle 293 表达培养基中解冻 FreeStyle 293-F 细胞。

需要的材料

在开始之前您需要准备好以下试剂：

  • FreeStyle 293-F 细胞（随试剂盒提供；将冷冻细胞储存在液氮中直至准备使用）
  • FreeStyle 293 表达培养基（随试剂盒提供；预热）注：我们不建议在培养基中添加抗生素，因为这可能对细胞生长产生负面影响。
  • 125 mL 一次性无菌聚碳酸酯锥形瓶
  • 设置为含 8% CO2 的湿润环境的 37°C 培养箱中的定轨摇床
  • 室温台式离心机和无菌离心管
  • 用于测定活细胞和细胞总数的试剂
  • 50 mL 无菌锥形管

解冻程序

将冷冻细胞储存在液氮中，直至准备使用。解冻和建立细胞：

  1. 从液氮中取出细胞的冻存管，在 37°C 水浴中快速解冻。
  2. 在细胞完全解冻之前，用 70% 乙醇对管外部进行净化。将冻存管的全部内容物研磨并转移至含有 30 mL 预热 FreeStyle 293 表达培养基的 125 mL 一次性无菌聚碳酸酯锥形摇瓶中
  3. 在 37°C、含 8% CO2 的湿润培养箱中于转速为 125 rpm 的定轨摇床平台上孵育细胞。将培养瓶的盖拧松四分之一圈，以进行氧合/通气。
  4. 一旦培养物达到大于 1 x 106 个活细胞/mL（通常为 3-5 天），在无菌条件下将细胞悬浮液转移至离心管中并涡旋 10 秒。
  5. 测定活细胞和细胞总数。
  6. 在预热的 FreeStyle 293 表达培养基中对 FreeStyle 293-F 细胞进行传代培养，以 3 x 105 个活细胞/mL 的密度接种至摇瓶中。我们通常使用 125 或 250 mL 一次性无菌聚碳酸酯锥形瓶，其中分别加入 20 或 40 mL 总工作体积的细胞悬浮液。

重要注意事项：在用于转染实验之前对细胞再进行至少两次传代培养，以允许细胞从解冻中复苏。如需对细胞进行传代培养，请参见以下程序。

细胞传代培养

细胞传代

当细胞密度约为 2-3 x 106 个活细胞/mL 时对细胞进行传代培养，约每 3-4 天传代一次。培养 FreeStyle 293-F 细胞时，我们通常使用 125 或 250 mL 一次性无菌聚碳酸酯锥形瓶，其中分别加入 25 至 40 mL 或 50 至 80 mL 总工作体积的细胞悬浮液。注：可以使用不带缓冲底的玻璃培养瓶，但在每次使用后必须进行彻底清洁，以避免潜在毒性（这在无血清培养中是一个较大问题）。

  1. 测定活细胞和细胞总数。
  2. 使用步骤 1 中测定的细胞密度，计算以 3 x 105 的密度接种新摇瓶所需的传代比率
  3. 在新制备的预热 FreeStyle 293 表达培养基中稀释细胞，使所需最终体积中的最终细胞密度为 0.1-0.2 x 106 个活细胞/mL。
  4. 在 37°C、含 8% CO2 的湿润培养箱中于转速为 135 rpm 的定轨摇床平台上孵育培养瓶。
  5. 必要时重复步骤 1-5 以维持或扩增细胞。监测细胞结团程度（见下文）。

建议：FreeStyle 293-F 悬浮培养物可能以 2-10 个细胞簇的形式生长。在每次传代培养时可能需要剧烈涡旋 10-30 秒，持续传代数次，直至培养物主要以单细胞形式生长。

扩大细胞培养规模

可以在转瓶或生物反应器中扩大 FreeStyle 293-F 培养规模。应为每个系统确定和优化合适的旋转速度或叶轮转速和接种密度。在我们的实验室中，Celligen™ 搅拌罐式生物反应器的最佳旋转速度为 100-130 rpm 和 70-100 rpm 叶轮转速。我们建议以 3-5 x 105 个活细胞/mL 的密度接种细胞。

注：如果细胞与新鲜培养基的平分比数小于 1:2，则您可能需要对细胞悬浮液进行离心，然后将细胞沉淀重悬于预热的新鲜 FreeStyle 293 表达培养基中，之后再接种转瓶或生物反应器培养物。监测细胞活力和细胞结团程度。请注意，大量细胞结团可能会降低转染效率。建议： 在较高搅拌速度（即大于 130 rpm）下和/或根据叶轮设计，您可能需要向 FreeStyle 293 表达培养基中补充额外的 Pluronic® F-68（2.5-5 mL/L 10% Pluronic® F-68，货号 24040），以避免培养中产生剪应力。

Pluronic® 是 BASF Corporation 的注册商标。Celligen™ 是 New Brunswick Corp 的注册商标。

冷冻细胞

介绍

您可以直接在 FreeStyle 293 表达培养基中冷冻 FreeStyle 293-F 细胞。冷冻 FreeStyle 293-F 细胞系时，我们建议遵循以下要求：

  • 以 5-8 x 106 个活细胞/mL 的密度冷冻细胞。
  • 使用由 90% 新鲜 FreeStyle 293 表达培养基和 10% DMSO 组成的冻存培养基。本节提供了制备冻存培养基和冷冻细胞的指南。

制备冻存培养基

临使用前制备冻存培养基。

  1. 对于每 1 mL 所需冻存培养基，在无菌锥形离心管中混合以下试剂： FreeStyle 293 表达培养基 0.9 mL、DMSO 0.1 mL
  2. 对冻存培养基进行过滤除菌，然后将试管置于冰上，直至使用。使用后，丢弃所有剩余的冻存培养基。

冷冻细胞

开始前，标记冻存管并制备冻存培养基。将冻存培养基放置在冰上。

  1. 在摇瓶中培养所需数量的 FreeStyle 293-F 细胞，当细胞密度达到 0.5 至 1 x 106 个活细胞/mL 时收获。将细胞转移至一个无菌锥形离心管中。
  2. 测定活细胞和总细胞计数，并计算为达到 5-8 x 106 个活细胞/mL 这一最终细胞密度所需的冻存培养基体积。
  3. 在室温下以 100 x g 离心细胞 5 分钟，然后小心吸出培养基。
  4. 将细胞重悬于预定体积的冷却冻存培养基中。
  5. 将冻存管放置在微量离心机架中，然后将 1 mL 细胞悬浮液等分至每个冻存管中。
  6. 按照标准程序在自动或手动、受控速率冷冻装置中冷冻细胞。为实现理想的冻存效果，冷冻速率应每分钟降低 1°C。
  7. 将冻存管转移至液氮中，以进行长期储存。

注：在液氮中储存冻存管后 24 小时，您可以按照“解冻与建立细胞”中所概述的程序来检查冷冻细胞的活力和回收率。

转染细胞

介绍

要转染悬浮 FreeStyle 293-F 细胞，您将需要使用试剂盒随附的阳离子脂质体转染试剂 293fectin。与其他一些无血清培养基配方不同，FreeStyle 293 表达培养基不会抑制阳离子脂质体介导的转染。FreeStyle 293 表达培养基经过专门配制，无需更换或添加培养基即可高效转染悬浮 FreeStyle 293-F 细胞。可使用较大体积进行瞬时转染实验，从而实现更大规模的蛋白生产。

293fectin 

293fectin 是一种适用于将核酸转染至真核细胞中的具有专利技术的制剂。在 FreeStyle 293 表达系统中，使用 293fectin 转染 FreeStyle 293-F 细胞具有以下优势：

  • 293fectin 在悬浮 FreeStyle 293-F 细胞（在 FreeStyle 293 表达培养基中培养）中显示具有较高转染效率
  • DNA-293fectin 复合物可直接添加到培养基中的细胞中
  • 转染后无需去除复合物或者更换或添加培养基。293fectin 可单独提供。有关更多信息，请访问我们的网站或致电技术服务部门。

Opti-MEM I

Gibco Opti-MEM I 减血清培养基随附于 FreeStyle 293 表达系统中，以帮助更好地形成 DNA-293fectin 复合物。Opti-MEM I 是改良版 Eagle 最低必需培养基，使用 HEPES 和碳酸氢钠作为缓冲系统，并添加了次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子。蛋白质水平极低 (15 µg/mL)，胰岛素和转铁蛋白是其中仅有的蛋白质补充剂。包含较低浓度的酚红作为 pH 值指示剂。Opti-MEM I 减血清培养基可单独提供。

阳性对照

提供 pCMV SPORT-βgal 作为阳性对照载体，用于在 FreeStyle 293-F 细胞中进行转染和表达。在人巨细胞病毒 (CMV) 启动子的控制下，编码 β-半乳糖苷酶的基因在 FreeStyle 293-F 细胞中表达。成功的转染可使 β-半乳糖苷酶得以表达，可轻松检测其表达情况。有关 pCMV SPORT-βgal 的图谱。

β-半乳糖苷酶活性检测

您可以使用无细胞裂解物，通过活性检测来评估 β-半乳糖苷酶表达情况 (Miller, 1972)。我们提供 β-gal 检测试剂盒（货号 K1455-01），用于快速且轻松地检测 β-半乳糖苷酶表达情况。

质粒制备液

转染至真核细胞中的质粒 DNA 必须干净、无菌且无苯酚和氯化钠。污染物可能会杀死细胞，盐会干扰复合作用，从而降低转染效率。我们建议使用其中一个 Invitrogen PureLink HiPure 质粒试剂盒（货号 K2100-14 或 K2100-16）分离质粒 DNA。

注：请确保您的 DNA 制备液是无菌的，例如在使用前通过 0.22 μm 过滤器进行过滤。

需要提前准备的材料

在开始之前您需要准备好以下试剂：

  • 有关在 FreeStyle 293 表达培养基中培养的悬浮 FreeStyle 293-F 细胞的建议：计算转染实验所需的细胞数量，并相应地扩增细胞。请确保继续进行转染前细胞健康且存活率超过 90%。
  • 纯化的感兴趣质粒 DNA
  • 293fectin（随试剂盒提供；使用前在 +4°C 下储存）
  • Opti-MEM I 减血清培养基（随试剂盒提供；预热）
  • FreeStyle 293 表达培养基（随试剂盒提供；预热）注：请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这可能会降低转染效率。
  • 125 mL 一次性无菌聚碳酸酯锥形瓶
  • 设置为含 8% CO2 的湿润环境的 37°C 培养箱中的定轨摇床
  • 室温台式离心机和无菌锥形离心管
  • 用于测定活细胞和细胞总数的试剂
  • 无菌一次性聚碳酸酯弹扣盖管
  • 涡旋混合器

30 mL 转染的极佳条件

我们通常以 30 mL 的体积进行转染实验。为转染悬浮 FreeStyle 293-F 细胞，我们建议使用以下优化条件：

  • 最终转染体积：30 mL
  • 要转染的细胞数：3 x 107 个细胞（最终细胞密度为 1 x 106 个细胞/mL）
  • 质粒 DNA 用量：20-40 μg（我们通常使用 30 μg）
  • 293fectin 用量：40-80 μL（我们通常使用 60 μL）。每转染 1 μg 质粒 DNA，使用 2 μL 293fectin

注： 如果您使用的是其他 293 细胞，您可能需要检测不同用量的 293fectin（例如 30、40、50、60、80 μL）和 30 μg 质粒 DNA，以确定转染的极佳条件。

转染程序

按照以下程序转染体积为 30 mL 的悬浮 FreeStyle 293-F 细胞。请记住，您可以在转染期间将细胞保存在 FreeStyle 293 表达培养基中。我们建议您在实验中包括阳性对照 (pCMV SPORT-βgal) 和阴性对照（无 DNA、无 293fectin）。

  1. 转染前一天（第 1 天），确定实验所需的细胞数量。请记住，每转染 30 mL，您将需要含 3 x 107 个细胞的 28 mL FreeStyle 293 表达培养基。提示：如需在第 2 天转染细胞，则以 6~7 x 105 个活细胞/mL 的密度接种细胞。如需在第 3 天进行转染，则以 3~4 x 105 个细胞/mL 的密度接种细胞。
  2. 转染当天，将一小份细胞悬浮液等份试液转移至微量离心管中，使用台盼蓝染料排斥法测定活力和细胞结团量。剧烈涡旋 45 秒以打散细胞团块，并使用 Coulter 计数器或血细胞计数器测定细胞总数。细胞存活率必须超过 90%。重要提示：为获得极佳转染结果，请确保您有单细胞悬浮液。可能需要涡旋处理细胞 10 至 30 秒。
  3. 计算包含一次转染所需细胞数的细胞悬浮液体积（每转染 30 mL，您将需要 3 × 107 个细胞）。将含有细胞的摇瓶置于 37°C 培养箱的定轨摇床上
  4. 对于每份转染样本，通过以下操作制备脂质体-DNA 复合物：
  5. 在 Opti-MEM I 中稀释 30 μg 质粒 DNA，使得总体积为 1 mL。轻轻混匀。
  6. 在 Opti-MEM I 中稀释 60 μL 293fectin，使得总体积为 1 mL。轻轻混匀并在室温下孵育 5 分钟。注：孵育时间较长可能会导致活性下降。
  7. 孵育 5 分钟后，将稀释的 DNA 添加至稀释的 293fectin 中，使得总体积达到 2 mL。轻轻混匀。
  8. 在室温下孵育 20-30 分钟，以形成 DNA-293fectin 复合物。
  9. 在孵育 DNA-293fectin 复合物的同时，从培养箱中取出细胞悬浮液，并将适当体积的细胞混悬液（参见步骤 3）添加至每个无菌一次性 125 mL 锥形摇瓶中。进行一次 30 mL 转染时需添加总体积为 28 mL 的新鲜、预热 FreeStyle 293 表达培养基。
  10. DNA-293fectin 复合物孵育完成后，将来自步骤 4 的 2 mL DNA-293fectin 复合物添加至每个摇瓶中。向阴性对照摇瓶中添加 2 mL Opti-MEM I，而非 DNA-293fectin 复合物。每个摇瓶的总体积应为 30 mL，最终细胞密度约为 1 × 106 个活细胞/mL
  11. 在设置为含 8% CO2 的湿润环境的 37°C 培养箱中，在转速为 125 rpm 的定轨摇床上孵育细胞。
  12. 在转染后约 48 小时收获细胞或培养基（如果分泌重组蛋白），并测定重组蛋白表达。

优化蛋白表达

表达水平可能因重组蛋白的性质而异；因此，您可能需要进行时程实验（即，在转染后 24、48、72、96 小时收获细胞或培养基），以优化重组蛋白的表达。

扩大转染规模

可以使用较大体积（例如 1 升）进行转染实验。如果您希望转染较大体积的悬浮 FreeStyle 293-F 细胞，请相应地按比例放大每种试剂的体积。下表列出了 FreeStyle 293-F 细胞的转染体积为 1 升或 3.8 升时使用的建议条件。列出了 FreeStyle 293-F 细胞的转染体积为 30 mL 时使用的优化条件作为参考。请注意，转染条件可能因所用培养容器类型和细胞生长条件而异；因此，您可能需要进行中试研究，以优化转染条件。

转染体积细胞总数*DNA 用量DNA 稀释体积（用 Opti-MEM I 稀释）293fectin 用量293fectin 稀释体积（用 Opti-MEM I 稀释）脂质体/DNA 复合物体积
30 mL3 x 10730 μg至 1 mL60 μL至 1 mL2 mL
1 升1 x 1091 mg至 35 mL2 mL至 35 mL70 mL
3.8 升3.8 x 1093.8 mg至 125 mL7.6 mL至 125 mL250 mL

注：如果 FreeStyle 293-F 细胞未以单细胞悬浮液形式培养（即，如果观察到明显细胞结团），则转染效率可能会随体积增加而降低。

参考文献

  1. Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R (1977) Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.J Gen Virol 36:59–74.
  2. Harrison T, Graham F, Williams J (1977) Host-range Mutants of Adenovirus Type 5 Defective for Growth in HeLa Cells.Virology 77:319–329.
  3. Miller JH (1972) Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory).
25-0439    版本 C   2007 年 3 月 15 日