293FT 细胞系的培养与维持方案

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介绍

293FT 细胞系

293FT 细胞系是慢病毒生产的绝佳宿主。293FT 细胞系源自 293F 细胞系（见下文），能够稳定表达 pCMVSPORT6TAg.neo 质粒中的 SV40 大 T 抗原。SV40 大 T 抗原的表达受到人类巨细胞病毒 (CMV) 启动子的控制，表达水平较高，属于组成型表达。获得关于 pCMVSPORT6TAg.neo 的更多信息。

293FT细胞系的使用

有研究证实表达 SV40 大 T 抗原的人类293细胞的病毒生产效率较高 (Naldini et al., 1996)，这表明 293FT 细胞系是特别适合利用 Invitrogen ViraPower 慢病毒表达系统（货号 K4950-00 和 K4960-00）来生产慢病毒构建体的宿主。293母细胞系是一种永生化细胞系，由人类5型腺病毒 DNA 片段转化原代人胚肾细胞而制成（Graham et al., 1977；Harrison et al., 1977）。E1A 腺病毒基因在这些细胞中表达并参与一些病毒启动子的转录激活过程，这一机制使得这些细胞能够生成水平极高的蛋白。293-F 细胞系（货号11625）是293细胞系的快速生长变体，最初从 Pharmacopeia 的 Robert Horlick 处获得。

抗生素抗性

293FT 细胞可稳定表达源自 pCMVSPORT6TAg.neo 的新霉素抗性基因，因此应在含有 Gibco Geneticin（浓度见下文）的培养基中维持培养。293FT 细胞中新霉素抗性基因的表达受到 SV40 增强子/启动子的控制。

一般信息

常规细胞操作

请按以下通用指南来培养和维持 293FT 细胞。

  • 请确保所有与细胞接触的溶液和仪器都处于无菌状态。务必采用合适的无菌技术并在层流净化罩中工作。
  • 在开始实验之前，请确保已建立细胞系，并冻存一些备用细胞。我们建议您在实验中使用早期传代细胞。
  • 在日常维持培养细胞的过程中，请在汇合度 >80% 时对 293FT 细胞进行传代。传代之前避免让细胞过度生长。
  • 在含有 500 μg/mL Gibco Geneticin 的完全培养基中维持培养 293FT 细胞。
  • 通过台盼蓝拒染实验来确定细胞活力。对数期培养细胞的活力应 >90%。
  • 解冻或传代培养细胞时，将细胞转移至已升至室温的培养基中。
  • 转染之前，细胞应处于适当的汇合度，细胞活力应超过 90%

实验开始前

请确保已准备好下列溶液和用品：

  • 15 mL 无菌锥形管
  • 适当尺寸的组织培养瓶和移液器
  • 完全培养基
  • 50 mg/mL Gibco Geneticin
  • 磷酸盐缓冲液（PBS； 货号 10010-023）。
  • 细胞计数用试剂
  • 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液或其他胰蛋白酶溶液
  • 冷冻培养基
  • 桌面级离心冻存管（如有需要）

293FT 细胞的培养基

下表列出了推荐的完全培养基、冷冻培养基以及维持和培养 293FT 细胞系所需的抗生素浓度。注：与 293FT 细胞系配合使用的胎牛血清不得进行热灭活处理。

完全培养基[抗生素]冷冻培养基
D-MEM（高糖）500 μg/mL Gibco Geneticin90% 完全培养基
10% 胎牛血清 (FBS) 10% DMSO
0.1 mM MEM 非必需氨基酸 (NEAA)  
6 mM L-谷氨酰胺  
1 mM MEM 丙酮酸钠  
1% 青霉素-链霉素（可选）  

D-MEM 已含 4 mM L-谷氨酰胺，足以支持 293FT 细胞系的生长需求。不过，由于 L-谷氨酰胺会随时间的推移而缓慢失效，因此完全培养基需要添加 2 m  L-谷氨酰胺。这是为了确保完全培养基中 L-谷氨酰胺的浓度不随时间流逝因缓慢降解而变得过低。注：293FT 细胞在 6 mM L-谷氨酰胺条件下生长良好，但更高浓度的 L-谷氨酰胺可能会影响其生长。

制备培养基

请按下列说明，使用相关试剂来制备完全 D-MEM 培养基，其中含有 10% FBS、0.1 mM MEM 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠和 2 mM L-谷氨酰胺。在组织培养超净台中和无菌条件下执行所有步骤。

  1. 从 1 L D-MEM 瓶中吸走 100 mL D-MEM，替换为 100 mL FBS。
  2. 向培养基瓶中加入：
    200 mM L-谷氨酰胺 (100X) 10 mL
    10 mM MEM 非必需氨基酸 (100X) 10 mL
    100 mM MEM 丙酮酸钠 (100X) 10 mL
    可选：青霉素-链霉素 (100X) 10 mL
  3. 使用 0.45 μm 过滤装置对培养基进行除菌过滤。
  4. 将完全培养基置于 4℃ 下储存，直至使用。培养基在 4℃ 条件下可稳定放置6个月（避免引入污染）。
  5. 在分装的完全培养基中，加入 Geneticin 以制备含 500 μg/mL Geneticin 的完全培养基。

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解冻细胞

介绍

293FT 细胞系以冻存管形式供应，每管含 1×107 个细胞，冻存于 1 mL 冷冻培养基中。请将冷冻的 293FT 细胞保存于液氮中直至准备使用。

请至少在2级生物安全遏制设施中操作任何具有潜在生物危害的材料。本品含有二甲亚砜 (DMSO)，这是一种有害试材。请在操作前查阅材料安全数据表。

解冻细胞

使用下列步骤来解冻 293FT 细胞，以开始细胞培养。在不含 Geneticin 的预热完全培养基中解冻细胞。

  1. 从液氮中取出细胞冻存管并在 37℃ 水浴中快速解冻。
  2. 在细胞完全解冻之前，使用 70% 酒精对冻存管的外壁进行消毒，之后将细胞转移至含有 PBS 的 15 mL 无菌试管中。以 150-200 x g 对细胞进行简单离心，并将细胞重悬于不含 Geneticin 的 2 mL 完全培养基中。
  3. 将细胞转移至含 10 mL 完全培养基（不含 Geneticin）的 T-75 cm2 培养瓶中。
  4. 在 37℃ 下过夜孵育培养瓶，以帮助细胞贴附到瓶底。
  5. 第二天吸走培养基，并替换为含有 500 μg/mL Geneticin 的新鲜完全培养基。
  6. 孵育细胞并每日检查，直至细胞达到 80-90% 的汇合度。
  7. 之后对细胞进行传代培养

我们建议在解冻之后、开展其他应用之前至少对细胞传代培养三次。

传代培养细胞

介绍

请按本部分的建议和步骤来传代培养 293FT 细胞。在含有 500 μg/mL Geneticin 的完全培养基中维持培养单层贴壁细胞。

传代培养条件

请使用下列推荐的条件来传代培养 293FT 细胞。有关细胞传代培养的步骤，请见下文。

参数推荐条件
细胞密度T-75 cm2 至 T-162 cm2 一次性无菌
T-培养瓶。对于 T-75 cm2 培养瓶和
T-162 cm2 培养瓶，分别在 15-20 mL
和 40-50 mL 总工作体积下稀释细胞
接种密度2至5×104 个活细胞/cm2
培养条件37℃ 培养箱，含 5-10%
CO2 的湿化空气；拧松外盖
以帮助实现氧气交换/通风

测定细胞的活力与密度

请按照如下步骤，通过台盼蓝拒染法测定细胞活力和总细胞计数。

  1. 将一小部分细胞悬液转移至微量离心管中，并对细胞进行稀释，使得进行计数的细胞总数不少于100且不超过1,000。
  2. 向 1 mL 稀释后的细胞悬液中加入 100 μL 台盼蓝 (0.4%) 染色液。轻轻吹打均匀。
  3. 记录稀释比例。稀释比例等于总体积（细胞悬液的量和台盼蓝的量）除以细胞悬液的量。
  4. 将细胞与台盼蓝溶液共同孵育 1-2 分钟。
  5. 使用库尔特计数仪或使用血细胞计数池手动对所有细胞（包括蓝色细胞）进行计数。
  6. 将总计数乘以稀释比例，可得出悬液中的细胞总数（每毫升）。

  7. 如需测定细胞活力，则只对蓝色细胞进行计数。计算活力百分比：[1.00-(蓝色细胞数÷总细胞数)]×100

  8. 健康对数生长期的细胞活力至少应达到 95%。

传代培养细胞

使用以下步骤对 T-75 cm2 培养瓶中生长的 293FT 细胞进行传代培养。如果您使用的是其他尺寸的培养瓶，请按比例调整试剂体积。

  1. 吸走培养瓶中的全部培养基，并使用 10 mL PBS 洗涤细胞一次，以去除多余的培养基和血清。血清含有胰蛋白酶抑制剂。
  2. 向单层细胞中加入 2 mL 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液，并在室温下孵育 1-5 分钟直至细胞脱壁。在显微镜下检查细胞，确认大多数细胞都已脱壁。如果细胞仍处于贴壁状态，则需略微延长孵育时间，直至大多数细胞都已脱壁。
  3. 加入 8 mL 含有 Geneticin 的完全培养基，并将细胞悬液转移至 15 mL 无菌锥形管中。
  4. 测定细胞活力和总细胞数（参见上述步骤）。
  5. 以推荐密度（参见上表）接种细胞，使用含 500 μg/mL Geneticin 的预热完全培养基进行稀释。按照推荐方法（参见上表）孵育培养瓶。
  6. 在含有 500 μg/mL Geneticin 的完全培养基中维持培养单层贴壁细胞。
  7. 就转染方案而言，每份样本可能需要 6×106 个 293FT 细胞

冷冻细胞

介绍

建立细胞系之后，我们建议您按照如下步骤冷冻部分细胞，以备将来使用。

  • 以至少 1×107 个活细胞/mL 的密度冷冻细胞。
  • 请使用由 90% 完全培养基和 10% DMSO 组成的冷冻培养基。冷冻培养基须现用现配。对冷冻培养基进行除菌过滤，并储存于 +4℃ 下直至使用。使用后丢弃剩余的冷冻培养基。

冷冻细胞

开始前，标记冻存管并制备冷冻培养基（参见上述部分）。将冷冻培养基存放在冰上。

  1. 将所需数量的 293FT 细胞培养至 70-90% 的汇合度。
  2. 按照“传代培养细胞”部分的 1-3 步，从组织培养瓶中移出细胞。
  3. 测定细胞活力与总细胞数，并计算为实现最终细胞密度 ≥1×107 个细胞/mL 所需的冷冻培养基体积。
  4. 制备所需体积的冷冻培养基（见上文）。
  5. 在室温条件下，用台式离心机以 250 x g 的转速对细胞悬液（来自步骤2）离心5分钟。小心吸走培养基，并将细胞沉淀物重悬于预冷的冷冻培养基（已事先确定体积）中。
  6. 依据生产商说明，将此悬液（频繁混匀以维持细胞悬液的均质性）分装至冻存管中。
  7. 使用可控速率的自动化冷冻设备，或通过标准的人工操作步骤冷冻细胞。为获得理想的细胞冻存效果，冷冻速率应达到每分钟下降 1℃。
  8. 将冻存管转移至液氮中进行保存。

注：  冻存管在液氮中保存24小时之后，您可按照“解冻细胞”部分所列的步骤来检查冷冻细胞的活力和复苏效果。

转染细胞

转染方法

293FT 细胞系通常适用于使用标准方法进行的转染，包括磷酸钙沉淀（Chen & Okayama, 1987；Wigler et al., 1977）、脂质体介导的转染（Felgner et al., 1989；Felgner & Ringold, 1989）和电穿孔（Chu et al., 1987；Shigekawa & Dower, 1988）。我们通常使用基于阳离子脂质体的转染试剂来转染 293FT 细胞。推荐使用 Invitrogen Lipofectamine2000，不过其他转染试剂也适用。

瞬时转染

可用任何质粒对 293FT 细胞系进行瞬时转染。下方提供了常规操作指南。

  • 确保细胞在铺板时处于健康状态。细胞在传代前过度生长会降低转染效率。
  • 在转染前一天对细胞进行铺板，以确保细胞在转染时处于合适的汇合度（参见生产商就您所用转染试剂提供的建议）。示例：如果您使用 Lipofectamine 2000 作为转染试剂，请对细胞进行铺板，使之在转染时达到 90-95% 的汇合度。
  • 使用所选方法（见上文）将您的质粒构建体转染到 293FT 细胞系中。
  • 转染完成后，加入含有 500 μg/mL Geneticin 的新鲜生长培养基，让细胞恢复 24-48 小时，之后再针对感兴趣基因的表达进行试验。

生成稳定细胞系

293FT 细胞可作为宿主细胞，用来从大多数质粒中生成表达感兴趣基因的稳定细胞系（参见下方的注释）。请记住，引入的质粒必须包含一个新霉素抗性之外的筛选标记。然后可以通过转染和 Geneticin 与适当筛选试剂的双重筛选来生成稳定细胞系。

由于 293FT 细胞稳定表达 SV40 大 T 抗原，因此我们不建议使用包含 SV40 复制原点的质粒来生成稳定细胞系。

参考文献

  1. Chen, C., and Okayama, H. (1987) High-Efficiency Transformation of Mammalian Cells by Plasmid DNA.Mol.Cell.Biol.7, 2745-2752
  2. Chu, G., Hayakawa, H., and Berg, P. (1987) Electroporation for the Efficient Transfection of Mammalian Cells with DNA.Nucleic Acids Res.15, 1311-1326
  3. Felgner, P. L., Holm, M., and Chan, H. (1989) Cationic Liposome Mediated Transfection.Proc.West.Pharmacol.Soc.32, 115-121
  4. Felgner, P. L. a., and Ringold, G. M. (1989) Cationic Liposome-Mediated Transfection.Nature 337, 387- 388
  5. Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., and Nairn, R. (1977) Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5.J. Gen.Virol.36, 59-74
  6. Harrison, T., Graham, F., and Williams, J. (1977) Host-range Mutants of Adenovirus Type 5 Defective for Growth in HeLa Cells.Virology 77, 319-329
  7. Naldini, L., Blomer, U., Gage, F. H., Trono, D., and Verma, I. M. (1996) Efficient Transfer, Integration, and Sustained Long-Term Expression of the Transgene in Adult Rat Brains Injected with a Lentiviral Vector.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 11382-11388
  8. Shigekawa, K., and Dower, W. J. (1988) Electroporation of Eukaryotes and Prokaryotes: A General Approach to the Introduction of Macromolecules into Cells.BioTechniques 6, 742-751
  9. Southern, P. J., and Berg, P. (1982) Transformation of Mammalian Cells to Antibiotic Resistance with a Bacterial Gene Under Control of the SV40 Early Region Promoter.J. Molec.Appl.Gen.1, 327-339
  10. Wigler, M., Silverstein, S., Lee, L.-S., Pellicer, A., Cheng, Y.-C., and Axel, R. (1977) Transfer of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene to Cultured Mouse Cells.Cell 11, 223-232
R700-07           2010年7月14日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。