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描述
Lipofectamine® LTX 试剂是一种具有专利技术的非动物源性阳离子脂质体制剂，用于将 DNA 转染至真核细胞中，可实现以下目标：
- 可针对许多细胞类型和规格（例如 96 孔）提供极高的转染表达性能以及较低的细胞毒性。
- 提供简单的 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物形成实验方案。
- Lipofectamine® LTX 试剂的细胞毒性有所降低，可以使用更大范围的脂质体剂量，尽管存在细胞密度差异、轻微移液不准确以及其他差异，但仍可提供很好的转染结果。
- 对于许多细胞系，使用 PLUS™ 试剂（也可单独提供，货号 11514-015）可增强转染性能。
转染指南
- 为获得极佳的结果，在遵循标准方案或高通量方案进行操作之前，如“优化转染”中所述优化 DNA 和脂质体用量。
- 在转染过程中向培养基中添加抗生素可能导致某些细胞系中的细胞死亡。单独检测每个细胞系。
- Lipofectamine® LTX 试剂在基于载体的 RNAi 实验中表现良好。对于 siRNA 和 Stealth™ RNA 转染，我们建议使用 Lipofectamine® RNAiMAX（货号 13778-075）。
- 请访问我们的网站或联系技术支持部，以了解专用转染方案（包括关于使用 PLUS™ 试剂和抗生素的细胞类型特定建议以及基于载体的 RNAi 方案）。
- 我们建议使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂，然后形成复合物。
- 在实验之间保持相同的接种条件。可以在存在或不存在血清的情况下进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的兼容性。
为获得极高的转染性能，使用一系列 DNA 和 Lipofectamine® LTX 用量（含或不含 PLUS™ 试剂）按如下所述对 24 孔规格进行优化。对于其他规格，请根据“扩大或缩小转染规模”调整用量（如下）。考虑改变细胞密度以进一步进行优化。注：请访问 www.lifetechnologies.com/transfection，以了解细胞特定转染方案。
| 细胞 | DNA | Lipofectamine® LTX | PLUS™ 试剂 |
|---|---|---|---|
| 敏感细胞 (HeLa, HT1080) | 250 ng | 0.375 µL - 1.25 µL | 0.125 µL - 0.5 µL |
| 大多数细胞系 | 500 ng | 0.75 µL - 3.0 µL | 0.25 µL - 1.0 µL |
| 750 ngl | 1.125 µL - 4.5 µL | 0.375 µL - 1.5 µL | |
| 悬浮和稳健的细胞1 | 1000 ng | 1.5 µL - 5.0 µL | 0.5 µL - 2.0 µL |
1 实例包括 MCF7、A549、Jurkat、THP1 和 HL60
根据上述方法优化反应后，使用这些指南以 24 孔规格将 DNA 转染到哺乳动物细胞中。如果使用 PLUS™ 试剂，则以 1:1 的 DNA (μg) 与 PLUS™ 试剂 (μL) 比例开始操作。所有用量均按每个孔计算。注：使用抗生素前，请阅读重要的转染指南（如上）。
- 贴壁细胞：转染前一天，在 500 μL 生长培养基中对细胞进行铺板，使细胞在转染时的汇合度达到 50-80%。悬浮细胞：在即将制备复合物之前，在 500 μL 生长培养基中对 100,000-250,000 个细胞进行铺板。
- 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：
- a. 在 100 μL Opti-MEM® I 减血清培养基中稀释优化用量的质粒 DNA。彻底混匀。
- b. 仅当使用 PLUS™ 试剂时：使用前轻轻混匀 PLUS™ 试剂，将优化体积的 PLUS™ 试剂直接添加至已稀释 DNA 中。轻轻混匀并在室温下孵育 5 分钟。
- c. 使用前轻轻混匀 Lipofectamine® LTX，然后将优化体积直接添加至已稀释 DNA 中。彻底混匀。
- d. 在室温下孵育 30 分钟。DNA-脂质体复合物在室温下稳定保存 6 小时。
- 向含有细胞的孔中逐滴添加约 100 μL DNA-脂质体复合物（步骤 2 d，如上）。通过来回摇动平板轻轻混匀。
- 在进行转基因表达检测前，在 CO2 培养箱中于 37° C 下孵育细胞 18-48 小时。培养基可在 4-6 小时后更换。
对于高通量转染或如要分配少量试剂，请使用这些指南。首先对试剂进行预稀释，然后向已稀释 DNA 中添加更大体积的试剂。丢弃未使用的已稀释试剂，因为已稀释脂质体在 5 分钟后会失去活性。对于 96 孔规格，所有用量均按每孔给出；对于其他规格，请参阅扩大或缩小转染规模（如下）。为获得极佳的结果，如“优化转染”中所述优化转染
注：使用抗生素前，请查阅重要的转染指南（如上）。
- 贴壁细胞：转染前一天，在 100 μL 生长培养基中对细胞进行铺板，使细胞在转染时的汇合度达到 50-80%。悬浮细胞：在即将制备复合物之前，在 100 μL 不含抗生素的生长培养基中对 20,000-50,000 个细胞进行铺板。
- 对每份转染样本，按下列步骤制备 DNA-脂质体复合物：
- 在 10 μL Opti-MEM® I 减血清培养基中稀释优化用量的质粒 DNA。轻轻混匀。
- 仅当使用 PLUS™ 试剂时：轻轻混匀 PLUS™ 试剂。使用 Opti-MEM® I 减血清培养基制备稀释度为 1:10 的 PLUS™ 试剂。添加优化体积的已稀释 PLUS™ 试剂以稀释 DNA。轻轻混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
- 轻轻混匀 Lipofectamine® LTX。通过使用 Opti-MEM® I 减血清培养基制成稀释度为 1:10 的 Lipofectamine® LTX，制备“预混液”。等分适量的“预混液”（相当于优化用量的 Lipofectamine® LTX），并使用 Opti-MEM® I 减血清培养基将最终体积调至 10 μL/孔。轻轻混匀。
- 将已稀释 Lipofectamine® LTX 添加至已稀释 DNA 中。轻轻混匀。 5 分钟内继续执行下一步骤
- 在室温下孵育 30 分钟。DNA-脂质体复合物在室温下稳定保存 6 小时。
- 向每个含有细胞的孔中添加约 20 μL DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。通过来回摇动平板轻轻混匀。
- 在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育 18-48 小时，然后检测转基因表达。培养基可在 4-6 小时后更换。
使用任意方案转染后 1 天，以 1:10 的稀释度（或更高稀释度）将细胞传代至新鲜培养基中。次日添加选择培养基（如需要）
为在不同尺寸的组织培养容器中转染细胞，按下表中所示根据相对表面积按比例改变 DNA、Lipofectamine® LTX、PLUS™ 试剂细胞和培养基的用量（用量按每孔给出）。如“优化 24 孔规格的转染”中所述，确定 Lipofectamine® LTX、质粒 DNA 和 PLUS™ 试剂（如果使用）所需的极佳用量。
| 培养容器 | 每孔表面积 1 | 铺板培养基体积 | 稀释培养基体积 2 | 相对表面积（与 24 孔相比） |
|---|---|---|---|---|
| 96 孔 | 0.3 cm2 | 100 μL | 20 μL | 0.2X |
| 48 孔 | 1.0 cm2 | 200 μL | 40 μL | 0.4X |
| 24 孔 | 2 cm2 | 500 μL | 100 μL | 1X |
| 12 孔 | 4 cm2 | 1 mL | 200 μL | 2X |
| 6 孔 | 10 cm2 | 2 mL | 500 μL | 5X |
1 表面积可能不同，具体取决于生产商。
2 在高通量方案中，Lipofectamine® LTX 和 DNA 分别被稀释至稀释培养基总体积的一半。
您可以通过将细胞直接铺板到转染混合物中，进行快速 96 孔板转染。在平板中制备复合物，并向 100 μL 体积中直接添加密度为标准方案中规定的细胞密度的两倍的细胞。在存在复合物的情况下，细胞将照常粘附。
优化脂质体剂量，因为在大多数情况下，需要更多脂质体才能使用该方法实现极佳的转染。
15338.pps 2008 年 8 月 20 日