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使用 Lipofectamine 3000 试剂将质粒 DNA 转染到 MCF10A 细胞中
完全生长培养基
| 成分 | 货号 |
|---|---|
| Gibco Ham's F-12 营养混合物 | 11765054 |
| 5% 马血清 | – |
| 1 mM Gibco 丙酮酸钠 | 11360070 |
| 25 mM Gibco HEPES | 15630106 |
适当的培养技术和程序是确保转染成功的重要组成部分。传代培养（也称为传代）是指移除培养基并将培养物中的细胞转移到新鲜的生长培养基中，从而实现细胞增殖。请参阅我们为本实验方案提供的产品列表
传代
- 将细胞置于 T-75 培养瓶中维持培养。
- 使用 Gibco TrypLE 解离试剂。
- 每 3-4 天进行一次细胞传代，以确保细胞尚未衰老。
- 应仅在解冻后第5代至第25代之间进行细胞转染。
- 如果设计的是涉及转染的实验，请确保设置与细胞传代一致。
- 在实验开始前1天铺板用于转染的细胞。
接种用于转染的细胞
- 转染前一天，对 T-75 培养瓶中汇合度达 80%-90% 的细胞进行解离处理。
- 使用标准台盼蓝拒染法进行细胞计数。
- 转染当天，细胞培养物中的细胞活力必须 >90%，且汇合度达到 80%。
- 对于24孔板的单个孔，加入 500 μL 生长培养基，从中接种 2 × 105 个细胞。
转染方案
在转染当天（即细胞铺板后1天）执行以下步骤，这些步骤已针对使用 Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂处理24孔板的单孔进行了优化：
| 步骤 | 管 | 复合成分 | 每孔用量 （24孔） |
|---|---|---|---|
| 1 | 管1 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| Lipofectamine 3000 试剂 | 1.5 μL | ||
| 2 | 管2 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| DNA 量（DNA 浓度应为 0.5–5 μg/μL） | 0.5 μL | ||
| P3000™ 试剂 | 1 μL | ||
| 3 | 将管2溶液加入管1中，混匀 | ||
| 4 | 将步骤3所得混合物在室温下孵育 10-15 min | ||
| 5 | 向细胞中加入 50 μL 步骤4所得复合物； 轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中 | ||
转染效率分析
在转染 GFP 报告基因构建体后 48 h，通过显微镜和流式细胞仪评价细胞。为了评估转染效率，首先通过荧光显微镜观察细胞，以定性评估蛋白表达、形态和活力（图1）。然后，通过吸出培养基并替换为 250 μL 由 TrypLE 试剂与 1X DPBS (7:3) 组成的混合物，制备用于流式细胞分析的细胞。将细胞置于 37℃ 下孵育 10 min，然后使用移液器上下吹吸，确保以单细胞状态进行流式细胞分析。
图1.细胞转染后分析。(A) 荧光和 (B) 明场图像显示，转染效率为 10%-20%。
小贴士和技巧
- 转染时降低培养基中的血清含量（至 <10%）可以接受，但在转染后 4-24 h 内应替换为完全生长培养基。
- 转染过程中可使用抗生素。
- 流式细胞分析前，在明场显微镜下观察细胞，以核实细胞在与 TrypLE 试剂共同孵育后已呈解离状态。
扩大或缩小 Lipofectamine 3000 试剂转染规模
使用下表按比例缩放转染实验中各成分的用量。下面列出了最常见的实验规格。
| 培养容器 | 倍增系数* | 共用试剂 | DNA 转染 | siRNA 转染 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 生长培养基 | 用于制备复合物的 Opti-MEM 培养基 | DNA | P3000 试剂 | Lipofectamine 3000 试剂** | siRNA | Lipofectamine 3000 试剂** | ||
| 96孔 | 0.2 | 100 μL | 2 x 5 μL | 0.1 µg | 0.2 µL | 0.3 µL | 3 pmol | 0.3 µL |
| 48孔 | 0.5 | 250 μL | 2 x 12.5 μL | 0.25 µg | 0.5 µL | 0.75 µL | 7.5 pmol | 0.75 µL |
| 24孔 | 1 | 500 μL | 2 x 25 μL | 0.5 µg | 1 µL | 1.5 µL | 15 pmol | 1.5 µL |
| 12孔 | 2 | 1 mL | 2 x 50 μL | 1 µg | 2 µL | 3 µL | 30 pmol | 3 µL |
| 6孔 | 5 | 2 mL | 2 x 125 μL | 2.5 µg | 5 µL | 7.5 µL | 75 pmol | 7.5 µL |
| 60 mm | 11.05 | 5 mL | 2 x 250 μL | 5.5–11 µg | 11–22 µL | 17 µL | 166 pmol | 17 µL |
| 10 cm | 28.95 | 10 mL | 2 x 500 μL | 14–28 µg | 28–56 µL | 43 µL | 434 pmol | 43 µL |
| T-75 | 39.47 | 15 mL | 2 x 750 μL | 20–40 µg | 40–80 µL | 59 µL | 592 pmol | 59 µL |
| T-175 | 92.11 | 35 mL | 2 x 1.75 mL | 46–96 µg | 92–180 µL | 138 µL | 1,382 pmol | 138 µL |
*确定最佳试剂用量后，使用倍增系数确定新平板规格所需的试剂用量。
**根据方案确定所需的 Lipofectamine 3000 转染试剂最佳用量。
欲了解更多信息，请访问 thermofisher.com/3000
仅供科研使用，不可用于诊断目的。