使用 Lipofectamine® 2000 在96孔板中反向转染 Stealth™ RNAi 或 siRNA

Lipofectamine® 2000 试剂是一种专有制剂，可促进 Stealth™ RNA 分子或短干扰 RNA (siRNA) 向哺乳动物细胞的高效递送，以进行 RNAi 分析 (1, 2)。在此，我们描述了使用 Lipofectamine® 2000 进行的反向转染。反向转染是一种高通量 (HTP) 转染多种 siRNA 或 Stealth™ RNAi 双链体的方法，该方法非常适合与96孔板中预分配的 RNAi 双链体（如 Stealth™ RNAi 人类集合，可通过我们的网站 www.lifetechnologies.com 获取）结合使用。

与传统的 Lipofectamine® 2000 转染方案相比，反向转染将 RNA、转染试剂和细胞结合到经过改变的序列中。简言之，转染前在每个孔中加入不同的 RNAi 分子并与稀释后的 Lipofectamine® 2000 结合，以在每个孔中形成复合物。将细胞直接添加到 Lipofectamine® 2000-RNA 复合物中，在细胞贴附到孔壁的同时进行转染。

转染通用指南

使用 Lipofectamine® 2000 将 siRNA 或 Stealth™ RNAi 双链体反向转染到哺乳动物细胞中时，请遵循以下通用指南。

• 使用低传代细胞，转染前确保细胞健康且细胞活力大于 90%。该方案适用于贴壁细胞，因为用于悬浮细胞时，转染效率通常较低并且可能需要优化。
• 转染时不要向培养基中添加抗生素，因为这会降低转染效率并导致细胞死亡。要获得理想结果，请在复合物形成之前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基稀释 Lipofectamine®  2000、DNA 和 dsRNA 低聚物。
• 为提高准确性并降低试验变异性，我们推荐在每个样本条件下进行三次重复转染。

需要的材料

开始前请准备好以下材料：

• 在适当的生长培养基中培养的哺乳动物细胞系
• 感兴趣的 Stealth™ RNAi 或 siRNA（20 μM 储备液，储存在 1X RNA 退火/稀释缓冲液中）
• RNAi 对照品
• Lipofectamine® 2000 试剂（货号：11668-027 或 11668-019；在 +4℃ 下储存，使用前轻轻混匀）
• Opti-MEM® I 减血清培养基（预热；货号：31985-062 或 31985-070）
• 96孔组织培养板和组织培养耗材

按照此步骤，使用 Lipofectamine® 2000 将您的 siRNA 或 Stealth™ RNAi 双链体反向转染到96孔板内的哺乳动物细胞中。在孔中制备复合物，然后加入细胞和培养基。请记得在您的实验中设置适当的阳性和阴性对照。

1. 对于每个待转染孔，按如下步骤制备 DNA-RNAi 分子-Lipofectamine® 2000 复合物。
   
   
   • 使用前轻轻混匀 Lipofectamine® 2000，然后在另一个容器中，用 25 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 培养基稀释 0.25 μL Lipofectamine® 2000。轻轻混匀并在室温下孵育5分钟。
   • 在组织培养板的孔中，用 25 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 培养基稀释 15 pmol siRNA 或 Stealth™ RNAi。轻轻混匀。
   • 孵育5分钟后，将稀释后的 Lipofectamine® 2000 加到含有经稀释 RNAi 分子的孔中。轻轻混匀并在室温下孵育15分钟，以形成复合物。溶液可能变浑浊，但这并不会妨碍转染。
2. 向每个含有 RNAi 分子-Lipofectamine® 2000 复合物的孔中加入 100 μL 不含抗生素的完全生长培养基（含20,000个细胞）。由此得到的最终体积为 150 μL，最终 RNA 浓度为 100 nM。前后晃动孔板，轻轻混匀。
3. 将细胞置于 CO₂ 培养箱中在 37°C 下进行孵育，直至准备好收获细胞及检测靶基因。
   我们建议在转染后 24-48 小时收获细胞，以检测靶基因敲除。

转染优化。

• 建议以每孔 0.25 μL Lipofectamine® 2000 作为起点，但转染条件可能需要优化。建议范围为 0.125 μL-1 μL。
• 请注意，对于高效 RNAi 分子（即诱导 >90% 靶标敲低的 RNAi 分子），获得有效敲低所需的 dsRNA 量可能低于规定量。这需要根据每个细胞系的经验来确定。

1. Gitlin, L., Karelsky, S., and Andino, R. (2002) Nature 418, 430-434.
   
2. Yu, J.Y., DeRuiter, S.L., and Turner, D.L.(2002) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99, 6047-6052.