使用 Lipofectamine® LTX 试剂将质粒 DNA 转染到 A549 细胞中

介绍

Lipofectamine® LTX 试剂采用专有的无动物源性配方，用于将 DNA 转染到真核细胞中，且具有低细胞毒性。本参考文件提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂（货号 15338-100）将质粒 DNA 转染到人 A549 肺癌细胞（ATCC，货号 CCL-185）中的推荐程序。

转染重要指南

使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染到 A549 细胞中时，请遵循以下重要指南：

• 在转染时向培养基中加入抗生素可能导致细胞死亡，并且尚未在 A549 细胞中对此进行检测。如果您希望在转染时使用抗生素，请充分检测实验条件。
• 在实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞；在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
• 在存在或不存在血清的情况下，均可进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
• 使用 PLUS™ 试剂（货号 11514-015）可增强在 A549 细胞中的转染性能。
• 我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂。
• 请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部门以获取其他专用转染方案（包括有关使用 PLUS™ 试剂和抗生素的细胞类型特定建议，以及基于载体的 RNAi 方案）。
• Lipofectamine® LTX 试剂适用于基于载体的 RNAi 实验。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染，我们推荐使用 Lipofectamine® RNAiMAX（货号 13778-075）。请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部门以获取更多信息。

需要的材料

开始实验前请准备好以下试剂：

• 在补充以下物质的含 L-谷氨酰胺的 RPMI（货号 11875-085）中维持培养的 A549 细胞：10% 胎牛血清（货号 26140-079）和 0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（货号 11140-050）。在 37°C 下含 5% CO₂ 的条件下培养细胞。
• 目标质粒 DNA（100 ng/μl 或更高）
• Lipofectamine® LTX 试剂（储存在 +4°C 下直至使用）和 PLUS™ 试剂（如果需要；储存在 4°C 下）
• Opti-MEM® I 减血清培养基
• 适当的组织培养板和用品。

使用此程序，以24孔规格将质粒 DNA 转染到 A549 细胞中（对于其他规格，请参阅下文扩大或缩小转染）。所有用量和体积均以每孔计。

1. 转染前一天，使用胰蛋白酶处理细胞并进行细胞计数。每孔含 0.5 ml 完全生长培养基，用 4 x 10^₄ 个细胞铺板。转染当天，细胞密度应达到 50~80% 融合度。


2. 对于每个待转染细胞孔，将 0.5 μg DNA 稀释于 100 μl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。


3. 如果使用 PLUS™ 试剂：使用前轻轻混合 PLUS™ 试剂，然后将 0.5 μl PLUS™ 试剂（与 DNA 的比例为 1:1）直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混合，然后室温孵育 5-15 分钟。


4. 对于每个细胞孔，将 1.5-2.5 μl Lipofectamine® LTX 试剂加入上述稀释后的 DNA 溶液中，轻轻混合，然后室温孵育25分钟，以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。


5. 从细胞中去除生长培养基，然后更换为 0.5 ml 完全生长培养基。向每个含细胞孔中直接加入 100 μl DNA-Lipofectamine® LTX 复合物，并轻轻前后晃动培养板混合。


6. 转染后无需去除复合物。转染后将细胞在 37°C 的 CO₂ 培养箱中孵育 18-24 小时，然后检测转基因表达。

如要以不同组织培养规格转染 A549 细胞，请根据相对表面积，成比例地改变 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量，如下表所示（用量以每孔计）。

¹ 表面积可能因生产商而异。
² 如果 Lipofectamine® LTX 试剂由于体积过小而无法准确分配，且无法合并稀释液，请将 Lipofectamine® LTX 试剂在 Opti-MEM® I 减血清培养基中预稀释10倍，然后分配10倍的体积量（每孔应至少分配 1.0 μl）。丢弃任何未使用的稀释后 Lipofectamine® LTX 试剂。