Transfecting Plasmid DNA into ACHN Cells Using Lipofectamine® LTX Reagent

介绍

Lipofectamine LTX® 试剂采用专有的无动物源性配方,用于将 DNA 转染到真核细胞中,且具有低细胞毒性。本参考文件提供了使用 Lipofectamine LTX® 试剂将质粒 DNA 转染到 ACHN 人肾癌细胞(ATCC 货号 CRL-1611)中的推荐程序。

转染重要指南

使用 Lipofectamine LTX® 试剂转染 ACHN 细胞时,请遵循以下重要指南:

  • 在实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞;在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
  • 在存在或不存在血清的情况下,均可进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine LTX® 试剂的相容性。
  • 我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基(货号 31985-070)稀释 DNA 和 Lipofectamine LTX® 试剂。
  • 使用 PLUS™ 试剂(货号 11514-015)可增强在 ACHN 细胞中的转染性能
  • 请访问 www.lifetechnologies.com/genedelivery 或联系技术服务部门以获取其他专用转染方案。
  • Lipofectamine LTX® 试剂适用于基于载体的 RNAi 实验。对于 siRNA 和 Stealth RNAi 转染,我们推荐使用 Lipofectamine RNAiMAX。请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部门以获取更多信息。


需要的材料


开始实验前请准备好以下试剂:

  • 在补充以下物质的最低必需培养基 (MEM)(货号 11090-081)中维持培养的 ACHN 细胞:4 mM L-谷氨酰胺(货号 25030-081)、10% 胎牛血清(货号 16000-044)。在 37oC 下含 5% CO2 的条件下培养细胞。
  • 目标质粒 DNA。
  • Lipofectamine LTX® 试剂(储存在 +4oC下直至准备使用)和 PLUS™ 试剂(如果需要;储存在 4°C 下)
  • Opti-MEM® I 减血清培养基
  • 适当的组织培养板和用品

ACHN 细胞转染

使用此程序,以24孔规格将质粒 DNA 转染到 ACHN 细胞中(对于其他规格,请参阅下文扩大或缩小转染)。所有用量和体积均以每孔计。

  1. 转染前一天,使用胰蛋白酶处理细胞并进行细胞计数。每孔含 0.5 ml 完全生长培养基,用 1.25 x 105 个细胞铺板。转染当天,细胞密度应达到 50-80% 融合度。

  2. (可选)转染当天,从细胞中去除生长培养基,然后更换为 0.5 ml 完全生长培养基。

  3. 对于每个待转染细胞孔,将 0.5 μg DNA 稀释于 100 μl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。

  4. 如果使用 PLUS™ 试剂:使用前轻轻混合 PLUS™ 试剂,然后将 0.5 μl PLUS™ 试剂(与 DNA 的比例为 1:1)直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混合,然后室温孵育 5-15 分钟。

  5. 对于每个细胞孔,将 2.75-3.75 μl Lipofectamine LTX® 试剂加入上述稀释后的 Opti-MEM®:DNA 溶液中,轻轻混合,然后室温孵育30分钟,以形成 DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物。

  6. 孵育30分钟后,向每个含细胞孔中直接加入 100 μl DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物,并轻轻前后晃动培养板混合。

  7. 转染后无需去除复合物。转染后将细胞在 37oC 的 CO2 培养箱中孵育 18-24 小时,然后检测转基因表达。

扩大或缩小转染

培养容器 表面
积/
铺板培养基体积 细胞数/孔 稀释
培养基
体积
DNA Lipofectamine®
LTX 试剂
PLUS™
试剂
96孔0.3 cm2100 μl2.5 x 10420 μl100 ng 0.55-0.75 μl0.1 μl
48孔1 cm2200 μl5 x 10440 μl200 ng 1.1-1.5 μl0.2 μl
24孔2 cm2500 μl1.25 x 105100 μl500 ng2.75-3.75  μl0.5 μl
12孔4 cm21 ml2.5 x 105200 μl1 μg5.5-7.5 μl1.0 μl
6孔10 cm22 ml6.25 x 105500 μl2.5 μg13.75-18.75 μl2.5 μl
25-0987W      2006年11月17日