Lipofectamine® LTX 试剂采用专有的无动物源性配方,用于将 DNA 转染到真核细胞中,且具有低细胞毒性。本参考文件提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂(货号 15338-100)将质粒 DNA 转染到 Caco-2 人结直肠腺癌细胞(ATCC 货号 HTB-37)中的推荐程序。
转染重要指南
使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染到 Caco-2 细胞中时,请遵循以下重要指南:
- 在转染时向培养基中加入抗生素可能导致细胞死亡,并且尚未在 Caco-2 细胞中对此进行检测。如果您希望在转染时使用抗生素,请充分检测实验条件。
- 在实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞;在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
- 在存在或不存在血清的情况下,均可进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
- 使用 PLUS™ 试剂(货号 11514-015)可增强在 Caco-2 细胞中的转染性能。
- 我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基(货号 31985-062)稀释 DNA 和
- Lipofectamine® LTX 试剂。
- 请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部门以获取其他专用转染方案(包括有关使用 PLUS™ 试剂和抗生素的细胞类型特定建议,以及基于载体的 RNAi 方案)。
- Lipofectamine® LTX 试剂适用于基于载体的 RNAi 实验。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染,我们推荐使用 Lipofectamine™ RNAiMAX(货号 13778-075)。请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部门以获取更多信息。
需要的材料
开始实验前请准备好以下试剂:
- 在补充以下物质的含 L-谷氨酰胺的 DMEM(货号 11965-084)中维持培养的 Caco-2 细胞:0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液(货号 11140-050)和 10% 胎牛血清(货号 26140-079)。在 37°C 下含 5% CO2 的条件下培养细胞。
- 目标质粒 DNA(100 ng/μl 或更高)
- Lipofectamine® LTX 试剂(储存在 +4°C 下直至使用)和 PLUS™ 试剂(如果需要;储存在 4°C 下)
- Opti-MEM® I 减血清培养基
- 适当的组织培养板和用品
使用此程序,以24孔规格将质粒 DNA 转染到 Caco-2 细胞中(对于其他规格,请参阅下文扩大或缩小转染)。所有用量和体积均以每孔计。
- 转染前一天,使用胰蛋白酶处理细胞并进行细胞计数。每孔含 0.5 ml 完全生长培养基,用 4 x 104 个细胞铺板。转染当天,细胞密度应达到 50~80% 融合度。
- 对于每个待转染细胞孔,将 0.5 μg DNA 稀释于 100 μl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
- 如果使用 PLUS™ 试剂:使用前轻轻混合 PLUS™ 试剂,然后将 0.5 μl PLUS™ 试剂(与 DNA 的比例为 1:1)直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混合,然后室温孵育 5-15 分钟。
- 对于每个细胞孔,将 0.75-1.75 μl Lipofectamine® LTX 试剂加入上述稀释后的 DNA 溶液中,轻轻混合,然后室温孵育25分钟,以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。
- 从细胞中去除生长培养基,然后更换为 0.5 ml 完全生长培养基。向每个含细胞孔中直接加入 100 μl DNA-Lipofectamine® LTX 复合物,并轻轻前后晃动培养板混合。
- 转染后无需去除复合物。转染后将细胞在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育 18-24 小时,然后检测转基因表达。
如要以不同组织培养规格转染 Caco-2 细胞,请根据相对表面积,成比例地改变 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量,如下表所示(用量以每孔计)。
培养容器 | 表面 积/ 孔1 | 铺板培养基体积 | 细胞数/孔 | 稀释 培养基 体积2 | DNA | Lipofectamine® LTX 试剂 | PLUS™ 试剂 |
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96孔 | 0.3 cm2 | 100 μl | 8 x 103 | 20 μl | 100 ng | 0.15-0.35 μl | 0.1 μl |
48孔 | 1 cm2 | 200 μl | 2 x 104 | 40 μl | 200 ng | 0.3-0.7 μl | 0.2 μl |
24孔 | 2 cm2 | 500 μl | 4 x 104 | 100 μl | 500 ng | 0.75-1.75 μl | 0.5 μl |
12孔 | 4 cm2 | 1 ml | 8 x 104 | 200 μl | 1 μg | 1.5-3.5 μl | 1.0 μl |
6孔 | 10 cm2 | 2 ml | 2 x 105 | 500 μl | 2.5 μg | 3.75-8.75 μl | 2.5 μl |
1 表面积可能因生产商而异。
2 如果 Lipofectamine® LTX 试剂由于体积过小而无法准确分配,且无法合并稀释液,请将 Lipofectamine® LTX 试剂在 Opti-MEM® I 减血清培养基中预稀释10倍,然后分配10倍的体积量(每孔应至少分配 1.0 μl)。丢弃任何未使用的稀释后 Lipofectamine™ LTX 试剂。