Transfecting Plasmid DNA into CHO-K1 Cells Using Lipofectamine® LTX Reagent

介绍

Lipofectamine® LTX 试剂采用专有的无动物源性配方,用于将 DNA 转染到真核细胞中,且具有低细胞毒性。本参考文件提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂(货号 15338-100)将质粒 DNA 转染到 CHO-K1 中国仓鼠卵巢细胞(ATCC 货号 CRL-9618)中的推荐程序。

转染重要指南

使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染到 CHO-K1 细胞中时,请遵循以下重要指南:

  • 在转染时向培养基中加入抗生素可能导致细胞死亡。如果您希望在转染时使用抗生素,请充分检测实验条件。
  • 在实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞;在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
  • 在存在或不存在血清的情况下,均可进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
  • 我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基(货号 31985-062)稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂。
  • 请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部门以获取其他专用转染方案(包括有关使用 PLUS™ 试剂和抗生素的细胞类型特定建议,以及基于载体的 RNAi 方案)。
  • Lipofectamine® LTX 试剂适用于基于载体的 RNAi 实验。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染,我们推荐使用 Lipofectamine® RNAiMAX(货号 13778-075)。请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部门以获取更多信息。


需要的材料


开始实验前请准备好以下试剂:

  • 在补充以下物质的含 L-谷氨酰胺的 RPMI(货号 11875-085)中维持培养的 CHO-K1 细胞:10% 胎牛血清(货号 26140-079)和 0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液(货号 11140-050)。在 37°C 下含 5% CO2 的条件下培养细胞。
  • 目标质粒 DNA(100 ng/μl 或更高)
  • Lipofectamine® LTX 试剂(储存在 +4°C 下直至使用)
  • Opti-MEM® I 减血清培养基
  • 适当的组织培养板和用品

CHO-K1 细胞转染

使用此程序,以24孔规格将质粒 DNA 转染到 CHO-K1 细胞中(对于其他规格,请参阅下文扩大或缩小转染)。所有用量和体积均以每孔计。

  1. 转染前一天,使用胰蛋白酶处理细胞并进行细胞计数。每孔含 0.5 ml 完全生长培养基,用 4 x 104 个细胞铺板。转染当天,细胞密度应达到 50~80% 融合度。
  2. 对于每个待转染细胞孔,将 0.5 μg DNA 稀释于 100 μl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
  3. 对于每个细胞孔,将 0.75-2.75 μl Lipofectamine® LTX 试剂加入上述稀释后的 DNA 溶液中,轻轻混合,然后室温孵育25分钟,以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。
  4. 从细胞中去除生长培养基,然后更换为 0.5 ml 完全生长培养基。向每个含细胞孔中直接加入 100 μl DNA-Lipofectamine® LTX 复合物,并轻轻前后晃动培养板混合。
  5. 转染后无需去除复合物。转染后将细胞在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育 18-24 小时,然后检测转基因表达。

扩大或缩小转染

如要以不同组织培养规格转染 CHO-K1 细胞,请根据相对表面积,成比例地改变 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量,如下表所示(用量以每孔计)。

培养容器 表面
积/
1
铺板培养基体积 细胞数/孔 稀释
培养基
体积2
DNA Lipofectamine®
LTX 试剂
96孔0.3 cm2100 μl8 x 10320 μl100 ng0.15-0.55 μl
48孔1 cm2200 μl2 x 10440 μl200 ng0.3-1.1 μl
24孔2 cm2500 μl4 x 104100 μl500 ng0.75-2.75  μl
12孔4 cm21 ml8 x 104200 μl1 μg1.5-5.5 μl
6孔10 cm22 ml2 x 105500 μl2.5 μg3.75-13.75 μl


1 表面积可能因生产商而异。
2 如果 Lipofectamine® LTX 试剂由于体积过小而无法准确分配,且无法合并稀释液,请将 Lipofectamine® LTX 试剂在 Opti-MEM® I 减血清培养基中预稀释10倍,然后分配10倍的体积量(每孔应至少分配 1.0 μl)。丢弃任何未使用的稀释后 Lipofectamine® LTX 试剂。 

25-0931W         2006年6月9日