Transfecting Plasmid DNA into HCT-116 Cells Using Lipofectamine® LTX Reagent

介绍

Lipofectamine LTX® 试剂采用专有的无动物源性配方，用于将 DNA 转染到真核细胞中，且具有低细胞毒性。本参考文件提供了使用 Lipofectamine LTX® 试剂将质粒 DNA 转染到 HCT-116 人结肠癌细胞（ATCC 货号 CCL-247）中的推荐程序。

转染重要指南

使用 Lipofectamine LTX® 试剂转染 HCT-116 细胞时，请遵循以下重要指南：

  • 在实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞；在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
  • 在存在或不存在血清的情况下，均可进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine LTX® 试剂的相容性。
  • 我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-070）稀释 DNA 和 Lipofectamine LTX® 试剂。
  • 请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部门以获取其他专用转染方案（包括有关使用 PLUS™ 试剂和抗生素的细胞类型特定建议，以及基于载体的 RNAi 方案）。
  • Lipofectamine® LTX 试剂适用于基于载体的 RNAi 实验。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染，我们推荐使用 Lipofectamine® RNAiMAX（货号 13778-075）。请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部门以获取更多信息。


需要的材料

开始实验前请准备好以下试剂：

  • 在补充以下物质的最低必需培养基 (MEM)（货号 11090-081）中维持培养的 HCT-116 细胞：4 mM L-谷氨酰胺（货号 25030-081）、10% 胎牛血清（货号 16000-044）。在 37oC 下含 5% CO2 的条件下培养细胞。
  • 目标质粒 DNA。
  • Lipofectamine LTX® 试剂（储存在 +4oC 下直至准备使用）
  • Opti-MEM® I 减血清培养基
  • 适当的组织培养板和用品

HCT-116 细胞转染

使用此程序，以24孔规格将质粒 DNA 转染到 HCT-116 细胞中（对于其他规格，请参阅下文 扩大或缩小转染）。所有用量和体积均以每孔计。

  1. 转染前一天，使用胰蛋白酶处理细胞并进行细胞计数。每孔含 0.5 ml 完全生长培养基，用 1.25 x 105 个细胞铺板。转染当天，细胞密度应达到 50-80% 融合度。
  2. （可选）转染当天，从细胞中去除生长培养基，然后更换为 0.5 ml 完全生长培养基。
  3. 对于每个待转染细胞孔，将 0.5 μg DNA 稀释于 100 μl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
  4. 对于每个细胞孔，将 1.25-2.25 μl Lipofectamine LTX® 试剂加入上述稀释后的 Opti-MEM®:DNA 溶液中，轻轻混合，然后室温孵育30分钟，以形成 DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物。
  5. 孵育30分钟后，向每个含细胞孔中直接加入 100 μl DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物，并轻轻前后晃动培养板混合。
  6. 转染后无需去除复合物。转染后将细胞在 37oC 的 CO2 培养箱中孵育 18-24 小时，然后检测转基因表达。

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扩大或缩小转染

培养容器 表面
积/
孔 		铺板培养基体积 细胞数/孔 稀释
培养基
体积 		DNA Lipofectamine®
LTX 试剂
96孔0.3 cm2100 μl2.5 x 10420 μl100 ng0.35-0.55 μl
48孔1 cm2200 μl5 x 10440 μl200 ng0.7-1.1 μl
24孔2 cm2500 μl1.25 x 105100 μl500 ng1.75-2.75  μl
12孔4 cm21 ml2.5 x 105200 μl1 μg3.5-5.5 μl
6孔10 cm22 ml6.25 x 105500 μl2.5 μg8.75-13.75 μl

 

25-0988W    2006年11月17日