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Lipofectamine® LTX 试剂采用专有的无动物源性配方，用于将 DNA 转染到真核细胞中，且具有低细胞毒性。本参考文件提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂（货号 15338-100）将质粒 DNA 转染到 HUVEC 人脐静脉内皮细胞原代分离株（0 代 [Cambrex, East Rutherford, NJ]）中的推荐程序。
转染重要指南
使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染到 HUVEC 细胞中时，请遵循以下重要指南：
- 在转染时向培养基中加入抗生素可能导致细胞死亡，并且尚未在 HUVEC 细胞中对此进行检测。如果您希望在转染时使用抗生素，请充分检测实验条件。
- 在实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞；在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
- 在存在或不存在血清的情况下，均可进行转染。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
- 使用 PLUS™ 试剂（货号 11514-015）可增强在 HUVEC 细胞中的转染性能。
- 我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂。
- 请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部门以获取其他专用转染方案（包括有关使用 PLUS™ 试剂和抗生素的细胞类型特定建议，以及基于载体的 RNAi 方案）。
- Lipofectamine® LTX 试剂适用于基于载体的 RNAi 实验。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染，我们推荐使用 Lipofectamine® RNAiMAX（货号 13778-075）。请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部门以获取更多信息。
需要的材料
开始实验前请准备好以下试剂：
- 在内皮细胞培养基-2（Clonetics 货号 CC-3156）中维持培养的 HUVEC 细胞。在 37°C 下含 5% CO2 的条件下培养细胞。
- 目标质粒 DNA（100 ng/μl 或更高）
- Lipofectamine® LTX 试剂（储存在 +4°C 下直至使用）和 PLUS™ 试剂（如果需要；储存在 4°C 下）
- Opti-MEM® I 减血清培养基
- 适当的组织培养板和用品
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使用此程序，以24孔规格将质粒 DNA 转染到 HUVEC 细胞中（对于其他规格，请参阅下文
扩大或缩小转染）。所有用量和体积均以每孔计。
返回顶部- 转染前一天，使用胰蛋白酶处理细胞并进行细胞计数。每孔含 0.5 ml 完全生长培养基，用 4 x 104 个细胞铺板。转染当天，细胞密度应达到 50~80% 融合度。
- 对于每个待转染细胞孔，将 0.5 μg DNA 稀释于 100 μl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
- 如果使用 PLUS™ 试剂：使用前轻轻混合 PLUS™ 试剂，然后将 0.5 μl PLUS™ 试剂（与 DNA 的比例为 1:1）直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混合，然后室温孵育 5-15 分钟。
- 对于每个细胞孔，将 0.75-2.75 μl Lipofectamine® LTX 试剂加入上述稀释后的 DNA 溶液中，轻轻混合，然后室温孵育25分钟，以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。
- 从细胞中去除生长培养基，然后更换为 0.5 ml 完全生长培养基。向每个含细胞孔中直接加入 100 μl DNA-Lipofectamine® LTX 复合物，并轻轻前后晃动培养板混合。
- 转染后无需去除复合物。转染后将细胞在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育 18-24 小时，然后检测转基因表达。
如要以不同组织培养规格转染 HUVEC 细胞，请根据相对表面积，成比例地改变 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量，如下表所示（用量以每孔计）。
| 培养容器 | 表面 积/ 孔1 | 铺板培养基体积 | 细胞数/孔 | 稀释 培养基 体积2 | DNA | Lipofectamine® LTX 试剂 | PLUS™ 试剂 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 96孔 | 0.3 cm2 | 100 μl | 8 x 103 | 20 μl | 100 ng | 0.25-0.3 μl | 0.1 μl |
| 48孔 | 1 cm2 | 200 μl | 2 x 104 | 40 μl | 200 ng | 0.5-0.6 μl | 0.2 μl |
| 24孔 | 2 cm2 | 500 μl | 4 x 104 | 100 μl | 500 ng | 1.25-1.5 μl | 0.5 μl |
| 12孔 | 4 cm2 | 1 ml | 8 x 104 | 200 μl | 1 μg | 2.5-3.0 μl | 1.0 μl |
| 6孔 | 10 cm2 | 2 ml | 2 x 105 | 500 μl | 2.5 μg | 6.25-7.5 μl | 2.5 μl |
1 表面积可能因生产商而异。
2 如果 Lipofectamine® LTX 试剂由于体积过小而无法准确分配，且无法合并稀释液，请将 Lipofectamine® LTX 试剂在 Opti-MEM® I 减血清培养基中预稀释10倍，然后分配10倍的体积量（每孔应至少分配 1.0 μl）。丢弃任何未使用的稀释后 Lipofectamine® LTX 试剂。
25-0938W 2006年6月9日