Lipofectamine LTX® 试剂是一种专有的无动物源性制剂,其细胞毒性较低,适用于将 DNA 转染到真核细胞中。本参考资料提供了使用 Lipofectamine LTX® 试剂将质粒 DNA 转染到 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞(ATCC 货号 HTB-26)中的推荐步骤。
转染重要指南
使用 Lipofectamine LTX® 试剂转染 MDA-MB-231 细胞时,请遵循以下重要指南:
- 在各实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞;转染前确保细胞健康且细胞活力大于 90%。
- 转染既可在有血清的条件下进行,也可在无血清的条件下进行。检测无血清培养基与 Lipofectamine LTX® 试剂的相容性。
- 我们建议,在络合之前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基(货号 31985-070)稀释 DNA Lipofectamine LTX® 试剂。
- 使用 PLUS™ 试剂(货号 11514-015)可增强 MDA-MB-231 细胞中的转染性能。
- 关于其他专业转染方案,请访问 www.lifetechnologies.com/genedelivery 或联系技术服务部。
- Lipofectamine LTX® 试剂在基于载体的 RNAi 实验中表现良好。对于 siRNA 和 Stealth RNAi 转染,我们建议使用 Lipofectamine RNAiMAX。有关更多信息,请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部。
需要的材料
开始前请准备好以下试剂:
- 在添加了 4 mM L-谷氨酰胺(货号 25030-081)和 10% 胎牛血清(货号 16000-044)的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM)(货号 11960-044)中维持培养的 MDA-MB-231 细胞。在37℃、5% CO2 的条件下培养细胞。
- 感兴趣的质粒 DNA。
- Lipofectamine LTX® 试剂(在 +4℃下储存直至使用)
- Opti-MEM® I 减血清培养基
- 适当的组织培养板和耗材。
31985070,11514015,11960044,25030081,16000044
按照以下步骤将质粒 DNA 转染至24孔板中的 MDA-MB-231 细胞中(对于其他规格,请参见下文的扩大或缩小转染规模)。指定的所有数量和体积均以每个孔为基础。
- 转染前一天,用胰蛋白酶处理细胞并进行计数。在含有 0.5 mL 完全生长培养基的每个孔中铺 1.25×105 个细胞。转染当天细胞密度应为 50-80% 汇合度。
- (可选)转染当天,从细胞中吸走生长培养基,替换为 0.5 mL 完全生长培养基。
- 对于每个孔的待转染细胞,将 0.5 μg DNA 稀释到 100 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
- 如果使用 PLUS™ 试剂:使用前轻轻混匀 PLUS™ 试剂,然后将 0.5 μL PLUS™ 试剂(与 DNA 的比例为 1:1)直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混匀并在室温下孵育 5-15 分钟。
- 对于每个孔的细胞,将 1.25-2.25 μL Lipofectamine LTX® 试剂添加到上述稀释后的 Opti-MEM®:DNA 溶液中,轻轻混匀并在室温下孵育30分钟,以形成 DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物。
- 孵育30分钟后,将 100 μL DNA-Lipofectamine LTX® 试剂复合物直接添加到含有细胞的每个孔中,并轻轻来回晃动孔板使其混匀。
- 转染后不必去除复合物。转染后,将细胞置于 CO2 培养箱中在 37℃下孵育 18-24 小时,然后测定转基因表达。
培养容器 | 每孔 表 面积 | 铺板培养基体积 | 细胞/孔 | 稀释 培养基 体积 | DNA | Lipofectamine® LTX 试剂 | PLUS™ 试剂 |
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96孔 | 0.3 cm2 | 100 μL | 2.5×104 | 20 μL | 100 ng | 0.25-0.45 μL | 0.1 μL |
48孔 | 1 cm2 | 200 μL | 5×104 | 40 μL | 200 ng | 0.5-0.9 μL | 0.2 μL |
24孔 | 2 cm2 | 500 μL | 1.25×105 | 100 μL | 500 ng | 1.25-2.25 μL | 0.5 μL |
12孔 | 4 cm2 | 1 mL | 2.5×105 | 200 μL | 1 μg | 2.5-4.5 μL | 1.0 μL |
6孔 | 10 cm2 | 2 mL | 6.25×105 | 500 μL | 2.5 μg | 6.25-11.25 μL | 2.5 μL |
25-0991W 2006年11月17日