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Lipofectamine® LTX 试剂是一种专有的无动物源性制剂，其细胞毒性较低，适用于将 DNA 转染到真核细胞中。本参考资料提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂（货号 15338-100）将质粒 DNA 转染到 NHFF 正常人包皮成纤维细胞（从 ATCC 获得）中的推荐步骤。
转染重要指南
使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染到 NHFF 细胞中时，请遵循以下重要指南：
- 转染过程中向培养基中添加抗生素可能导致细胞死亡，尚未对 NHFF 细胞进行该测试。如果您要在转染过程中使用抗生素，请充分测试您的转染条件。
- 在各实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞；转染前确保细胞健康且细胞活力大于 90%。
- 转染既可在有血清的条件下进行，也可在无血清的条件下进行。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
- 使用 PLUS™ 试剂（货号 11514-015）可增强 NHFF 细胞中的转染性能。
- 我们建议，在络合之前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂。
- 关于其他专业转染方案（包括关于特定细胞类型的 PLUS™ 试剂和抗生素使用建议，以及基于载体的 RNAi 的实验方案），请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部。
- Lipofectamine® LTX 试剂在基于载体的 RNAi 实验中表现良好。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染，我们建议使用 Lipofectamine® RNAiMAX（货号 13778-075）。有关更多信息，请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部。
需要的材料
开始前请准备好以下试剂：
- 在添加了 L-谷氨酰胺（货号 11965-084）、0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液（货号 11140-050）和 10% 胎牛血清（货号 26140-079）的 DMEM 中维持培养的 NHFF 细胞。在 37℃、5% CO2 的条件下培养细胞。
- 感兴趣的质粒 DNA（100 ng/μL 或更高）
- Lipofectamine® LTX 试剂（在 +4℃ 下储存直至使用）和 PLUS™ 试剂（如果需要；在 4℃ 下储存）
- Opti-MEM® I 减血清培养基
- 适当的组织培养板和耗材。
按照以下步骤将质粒 DNA 转染至24孔板中的 NHFF 细胞中（对于其他规格，请参见下文的扩大或缩小转染规模）。指定的所有数量和体积均以每个孔为基础。
- 转染前一天，用胰蛋白酶处理细胞并进行计数。在含有 0.5 mL 完全生长培养基的每个孔中铺 4×104 个细胞。转染当天细胞密度应为 50-80% 汇合度。
- 对于每个孔的待转染细胞，将 0.5 μg DNA 稀释到 100 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。
- 如果使用 PLUS™ 试剂：使用前轻轻混匀 PLUS™ 试剂，然后将 0.5 μL PLUS™ 试剂（与 DNA 的比例为 1:1）直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混匀并在室温下孵育 5-15 分钟。
- 对于每个孔的细胞，将 1.25-2.25 μL Lipofectamine® LTX 稀释到上述稀释后的 DNA 溶液中，轻轻混匀并在室温下孵育25分钟，以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。
- 从细胞中吸走生长培养基，替换为 0.5 mL 完全生长培养基。将 100 μL
- DNA-Lipofectamine® LTX 复合物直接添加到含有细胞的每个孔中，并轻轻来回晃动孔板使其混匀。
- 转染后不必去除复合物。转染后，将细胞置于 CO2 培养箱中在 37°C 下孵育 18-24 小时，然后测定转基因表达。
要在不同规格的组织培养容器中转染 NHFF 细胞，应根据相对表面积按比例调整 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量，如表格所示（指定的量以每个孔为基础）。
| 培养容器 | 每孔 表 面积1 | 铺板培养基体积 | 细胞/孔 | 稀释 培养基 体积2 | DNA | Lipofectamine® LTX 试剂 | PLUS™ 试剂 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 96孔 | 0.3 cm2 | 100 μL | 8×103 | 20 μL | 100 ng | 0.25-0.45 μL | 0.1 μL |
| 48孔 | 1 cm2 | 200 μL | 2×104 | 40 μL | 200 ng | 0.5-0.9 μL | 0.2 μL |
| 24孔 | 2 cm2 | 500 μL | 4×104 | 100 μL | 500 ng | 1.25-2.25 μL | 0.5 μL |
| 12孔 | 4 cm2 | 1 mL | 8×104 | 200 μL | 1 μg | 2.5-4.5 μL | 1.0 μL |
| 6孔 | 10 cm2 | 2 mL | 2×105 | 500 μL | 2.5 μg | 6.25-11.25 μL | 2.5 μL |
1 表面积可能因生产商而异。
2 如果 Lipofectamine® LTX 试剂的体积太小而无法准确分配，并且无法合并稀释液，则在 Opti-MEM® I 减血清培养基中将 Lipofectamine® LTX 试剂预稀释10倍，然后分配10倍的量（应至少为 1.0 μL/孔）。丢弃任何未使用的经稀释 Lipofectamine® LTX 试剂。
25-0944W 2006年6月9日