NHFF cells

介绍

Lipofectamine® LTX 试剂是一种专有的无动物源性制剂,其细胞毒性较低,适用于将 DNA 转染到真核细胞中。本参考资料提供了使用 Lipofectamine® LTX 试剂(货号 15338-100)将质粒 DNA 转染到 NHFF 正常人包皮成纤维细胞(从 ATCC 获得)中的推荐步骤。

转染重要指南

使用 Lipofectamine® LTX 试剂将 DNA 转染到 NHFF 细胞中时,请遵循以下重要指南:

  • 转染过程中向培养基中添加抗生素可能导致细胞死亡,尚未对 NHFF 细胞进行该测试。如果您要在转染过程中使用抗生素,请充分测试您的转染条件。
  • 在各实验之间保持相同的接种条件。使用低传代细胞;转染前确保细胞健康且细胞活力大于 90%。 
  • 转染既可在有血清的条件下进行,也可在无血清的条件下进行。检测无血清培养基与 Lipofectamine® LTX 试剂的相容性。
  • 使用 PLUS™ 试剂(货号 11514-015)可增强 NHFF 细胞中的转染性能。
  • 我们建议,在络合之前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基(货号 31985-062)稀释 DNA 和 Lipofectamine® LTX 试剂。
  • 关于其他专业转染方案(包括关于特定细胞类型的 PLUS™ 试剂和抗生素使用建议,以及基于载体的 RNAi 的实验方案),请访问 www.lifetechnologies.com/transfection 或联系技术服务部。
  • Lipofectamine® LTX 试剂在基于载体的 RNAi 实验中表现良好。对于 siRNA 和 Stealth™ RNAi 转染,我们建议使用 Lipofectamine® RNAiMAX(货号 13778-075)。有关更多信息,请访问 www.lifetechnologies.com/RNAi 或联系技术服务部。

需要的材料

开始前请准备好以下试剂:

  • 在添加了 L-谷氨酰胺(货号 11965-084)、0.1 mM MEM非必需氨基酸溶液(货号 11140-050)和 10% 胎牛血清(货号 26140-079)的 DMEM 中维持培养的 NHFF 细胞。在 37℃、5% CO2 的条件下培养细胞。
  • 感兴趣的质粒 DNA(100 ng/μL 或更高)
  • Lipofectamine® LTX 试剂(在 +4℃ 下储存直至使用)和 PLUS™ 试剂(如果需要;在 4℃ 下储存)
  • Opti-MEM® I 减血清培养基
  • 适当的组织培养板和耗材。

转染 NHFF 细胞

按照以下步骤将质粒 DNA 转染至24孔板中的 NHFF 细胞中(对于其他规格,请参见下文的扩大或缩小转染规模)。指定的所有数量和体积均以每个孔为基础。

  1. 转染前一天,用胰蛋白酶处理细胞并进行计数。在含有 0.5 mL 完全生长培养基的每个孔中铺 4×104 个细胞。转染当天细胞密度应为 50-80% 汇合度。

  2. 对于每个孔的待转染细胞,将 0.5 μg DNA 稀释到 100 μL 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基中。

  3. 如果使用 PLUS™ 试剂:使用前轻轻混匀 PLUS™ 试剂,然后将 0.5 μL PLUS™ 试剂(与 DNA 的比例为 1:1)直接加入稀释后的 DNA 中。轻轻混匀并在室温下孵育 5-15 分钟。

  4. 对于每个孔的细胞,将 1.25-2.25 μL Lipofectamine® LTX 稀释到上述稀释后的 DNA 溶液中,轻轻混匀并在室温下孵育25分钟,以形成 DNA-Lipofectamine® LTX 复合物。

  5. 从细胞中吸走生长培养基,替换为 0.5 mL 完全生长培养基。将 100 μL

  6. DNA-Lipofectamine® LTX 复合物直接添加到含有细胞的每个孔中,并轻轻来回晃动孔板使其混匀。

  7. 转染后不必去除复合物。转染后,将细胞置于 CO2 培养箱中在 37°C 下孵育 18-24 小时,然后测定转基因表达。

扩大或缩小转染规模

要在不同规格的组织培养容器中转染 NHFF 细胞,应根据相对表面积按比例调整 Lipofectamine® LTX 试剂、DNA、细胞、培养基和 PLUS™ 试剂的用量,如表格所示(指定的量以每个孔为基础)。

培养容器 每孔

面积1
铺板培养基体积 细胞/孔 稀释
培养基
体积2
DNA Lipofectamine®
LTX 试剂
PLUS™ 试剂
96孔0.3 cm2100 μL8×10320 μL100 ng0.25-0.45 μL0.1 μL
48孔1 cm2200 μL2×10440 μL200 ng0.5-0.9 μL0.2 μL
24孔2 cm2500 μL4×104100 μL500 ng1.25-2.25 μL0.5 μL
12孔4 cm21 mL8×104200 μL1 μg2.5-4.5 μL1.0 μL
6孔10 cm22 mL2×105 500 μL2.5 μg6.25-11.25 μL2.5 μL


1 表面积可能因生产商而异。
2 如果 Lipofectamine® LTX 试剂的体积太小而无法准确分配,并且无法合并稀释液,则在 Opti-MEM® I 减血清培养基中将 Lipofectamine® LTX 试剂预稀释10倍,然后分配10倍的量(应至少为 1.0 μL/孔)。丢弃任何未使用的经稀释 Lipofectamine® LTX 试剂。

25-0944W  2006年6月9日